Un Reporter Novel RFP per aiutare nella visualizzazione del Disco Eye immaginale in Drosophila</em

Sommario

Descriviamo un romanzo rosso proteina fluorescente (RFP), giornalista che si esprime in particolare nella Drosophila Occhio. Noi dettaglio una metodologia per la dissezione del disco occhio immaginale e come questo giornalista può essere utilizzato per facilitare la dissezione e l'identificazione di specifici tipi cellulari negli occhi di sviluppo.

Protocollo

1. Primo posto una goccia di PBS su un piatto Sylgard sotto un microscopio da dissezione.
2. Avanti rimuovere diversi larve erranti instar terzo da un flacone o bottiglia con una spatola e metterli in PBS.
3. Per iniziare la dissezione usare la pinzetta mano sinistra (se siete di mano destra) di cogliere una larva due terzi del cammino verso la parte posteriore e quindi utilizzare l'altra coppia per tenere la bocca ganci scuro di colore alla fine anteriore.
4. Ora estrarre delicatamente la larva a parte muovendo entrambe le coppie di pinzette distanza gli uni dagli altri. L'apparato boccale dovrebbe venire via dal resto del corpo con l'occhio / cervello complesso allegato.
5. Per i dischi macchia occhio per fissare immunofluorescenza i dischi a questo punto, mettendoli in 4% paraformaldeide / soluzione PBS per 30-45 minuti in ghiaccio. Quindi lavare i dischi quattro volte con PBST e macchia poi con anticorpi appropriati.
6. E 'più facile sezionare i dischi occhio direttamente su un vetrino. Mettere una goccia di PBS su un vetrino e spostare i dischi alla goccia di PBS tenendo l'apparato boccale.
7. I tessuti sono traslucidi immaginale e così in un primo momento i dischi occhio sono difficili da identificare. Per rendere più facile la loro identificazione usare un microscopio da dissezione con capacità di fluorescenza. Utilizzando l'occhio-RFP linea giornalista i dischi occhio può essere chiaramente visto come tessuto rosso fluorescente sovrapponendo i lobi ottici sferica (Figura 1).
8. Se si utilizza una fonte di fibra ottica a luce fredda direttamente la luce in un angolo obliquo alla diapositiva, in modo da dare al disco un maggiore contrasto. I dischi occhi / antenne sono collegate al lobi ottici attraverso il gambo ottico al posteriore e per l'apparato boccale attraverso un gambo provenienti dal disco antennale al anteriore.
9. Per sezionare i dischi occhio tenere l'apparato boccale con un paio di pinzette e utilizzare l'altra coppia di separare i dischi occhio dal cervello larvale. Avanti separare i dischi occhio dal boccale. Infine togliere il boccale dalla diapositiva in quanto questi può impedire il coprioggetto da posizione orizzontale.
10. Dopo aver sezionato tutti i dischi degli occhi dolcemente inclinare il vetrino e asciugare l'eccesso di PBS. Quindi aggiungere una goccia di Vectashield e delicatamente mettere un coprioggetto sulla parte superiore.
11. I dischi sono ora pronti per essere ripreso da una epifluorescenza e confocale (Figura 2).

Rappresentante Risultati

Quando sezionato correttamente l'occhio / antennale disco deve essere ben disteso sul vetrino chiara di qualsiasi tessuto estraneo come il cervello. I poli dorsale e ventrale del disco occhi sono curve e quindi tendono a volte, ma questo può essere evitato prendendo una serie Z su un microscopio confocale e omettendo queste sezioni dalla proiezione. Anche se il disco è un epitelio monostrato le posizioni variabile dei nuclei richiedono una serie Z di proiezione per ottenere un quadro generale del disco. Una proiezione di un tipico occhio-occhio RFP / disco antenne assunto un microscopio confocale è illustrato nella figura 2. Noi di solito prendere 1 micron sezioni attraverso il disco utilizzando un obiettivo 20x o 40x. L'occhio-RFP giornalista è localizzato nucleare e quindi il modello visto in Figura 2 rappresenta i nuclei delle cellule che esprimono RFP.

Figura 1. Dissezione iniziale dell'occhio / complesso cervello da un occhio-RFP larva terzo instar Drosophila. L'occhio / antenne disco immaginale (descritto) può essere visto attaccato al boccale (MP) e sovrapponendo il lobo ottico (OL) del cervello. L'immagine è stata scattata con un microscopio a fluorescenza dissezione per mostrare l'espressione RFP nel disco occhi. Anteriore è a sinistra. Scala grafica: 300 micron.

Figura 2. Espressione degli occhi-RFP giornalista nel disco occhio immaginale. Un terzo occhio instar (ED) / disco antenne (AD), sezionato da un occhio-RFP larva mostrando RFP espressione (rosso). Il disco era macchiata di falloidina (verde), che le macchie di superficie delle cellule apicali e mostra il solco morfogenetici (punta di freccia). RFP è espresso in cellule precursori di tutto il MF, in fotorecettori 1,6,7 e in coni. Anteriore è a sinistra. Scala grafica: 25 micron.

Discussione

Dissezione del disco occhio Drosophila immaginale è semplice, ma può richiedere tempo per padroneggiare. I passi fondamentali sono l'identificazione del disco occhio e la sua dissezione lontano dal cervello larvale. L'identificazione del disco occhio è reso più facile con l'occhio-RFP linea descritta qui. Eventuali modifiche devono rimuovere il disco antennali o la membrana peripodial, o di lasciare il lobo ottico collegato a visualizzare gli assoni PR entrare nel cervello.