Method Article

Misurare coefficienti di diffusione via a due fotoni di recupero fluorescenza Dopo photobleaching

DOI:

10.3791/1636

⸱

February 26th, 2010

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Rochester, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

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In questo articolo andremo a descrivere il procedimento per determinare coefficienti di diffusione multi-fotone con il recupero di fluorescenza dopo photobleaching. Inizieremo allineando il laser lungo il percorso ottico al campione e determinare i parametri corretti sperimentale, poi continuare a generare ed infine montaggio curve recupero fluorescenza.

Abstract

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Multi-fluorescenza recupero dopo photobleaching è una tecnica di microscopia utilizzato per misurare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) delle macromolecole, e può essere applicato sia

Protocol

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1. Allineare l'ottica.

L'attrezzatura fondamentale per un MP-FRAP esperimento comprendono: un modo bloccato sorgente laser, Cell Pockels (per la modulazione del fascio), generatore di impulsi, dicroici, lenti dell'obiettivo, emissione di fluorescenza filtro, tubo fotomoltiplicatore recintato, e un sistema di registrazione dei dati (fotoni contatore e multicanale scaler).

2. Determinare i poteri del monitor di sicurezza.

  1. Attenuare il laser ad un basso, ma ragionevole, il potere di generare fluorescenza all'interno del campione.
  2. Messa a fuoco all'interno del campione.
  3. Impostare un co....

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Discussion

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La potenza del multi-fotone recupero di fluorescenza dopo photobleaching risiede nella sua capacità di sondare i campioni di spessore con risoluzione 3D. Dal momento che il suo sviluppo nel 1990, MP-FRAP è stato utilizzato per determinare il coefficiente di diffusione (o parametri di trasporto analoghe) in corpi cellulari, ex fette di tessuto vivo di spessore, e nel tessuto vivo e nell'interstizio. In questo articolo, abbiamo presentato l'attrezzatura necessaria per eseguire u.......

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Acknowledgements

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Questo lavoro è stato finanziato da un Dipartimento di Era Difesa del Premio Speranza Scholar (n. W81XWH-05-0396) e un Scholar Pew al Premio Scienze Biomediche a Edward B. Brown III.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Laser Ti:zaffiroNewport Corp.Mai Tai
Pockels CellConoptics350-80
Microscopio a scansione laserOlympus CorporationFluoview
Specchio dicroico a passaggio cortoChroma Technology Corp.670 DCSX-2P
Tubo fotomoltiplicatoreHamamatsu Corp.HC125-02
Contatore di fotoniStanford Research SystemsSR 400
Scalatore/media multicanaleStanford Research SystemsSR 430
Generatore di impulsiStanford Research SystemsDG 535
FITC-BSAInvitrogen--

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
  2. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

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Two photon Fluorescence RecoveryFluorescence Recovery After PhotobleachingDiffusion Coefficient MeasurementLaser Beam AlignmentPockels Cell ModulationPhoton Counting AnalysisLabVIEW AutomationMATLAB Curve FittingAqueous Fluorescent DyeFluorescence Recovery Curve

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