Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

1) Preparazione della giunzione Drosophila melanogaster neuronale muscolare (NMJ)

1. Preparare standard di Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM saccarosio, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl _2, 5 Hepes mM, pH 7.3 ^4.
2. Sezionare la preparazione in soluzione salina (1,1). Le larve di Drosophila si struggeva dorsale laterale in un piatto Sylgard, il lato dorsale è sezionato longitudinale, e gli organi interni vengono rimossi. La preparazione è poi allungato e si struggeva. Diversi muscoli ventrali possono essere poi utilizzati.

2) La stimolazione e colorazione FM

1. Si consiglia di fare tutte le seguenti operazioni in condizioni di scarsa illuminazione, al fine di proteggere coloranti FM da sbiancamento.
2. Per la stimolazione chimica dei nervi, buffer di potassio alto viene utilizzato. Preparare Drosophila salina (cfr. punto 1.1) contenente 90 mM di KCl e 10 mM di FM1-43 colorante. Tenere la soluzione al riparo dalla luce.
3. Bagno la preparazione con il buffer precedentemente preparato per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Lavare con standard di Drosophila salina (1,1) per rimuovere extracellulare FM1-43 colorante. Procedere rapidamente alla fissazione.

3) di fissaggio

1. Bagno la preparazione con glutaraldeide al 2,5% in PBS (PBS) per 45 minuti a temperatura ambiente. Per la buona conservazione delle caratteristiche morfologiche, glutaraldeide è preferito a paraformaldeide.
2. Lavare una volta con PBS e poi lasciare la preparazione sommerso per 15 minuti in 100 mM di NH ₄ Cl. Questo passo è fatto al fine di estinguere i gruppi aldeidi libera del fissativo glutaraldeide rimanenti.
3. Lavare i ₄ soluzione Cl NH con normale PBS.

4) fotoconversione

1. Incubare la preparazione NMJ per 30 minuti a 4 ° C in PBS contenente 1,5 mg ml-1 di diaminobenzidina (DAB).
2. Posizionare il campione al microscopio a fluorescenza. Trovare e mettere a fuoco il segnale fluorescente con un relativamente basso dell'acqua obiettivo ingrandimento immersione (20x 0,5 NA).
3. Illuminare il campione con la massima intensità della lampada fino a quando il colorante FM è completamente sbiancato (Figura 1C). Per controllare se fotoconversione si è verificato, è consigliabile verificare presso il campione sotto la luce di trasmissione prima e dopo la tintura, candeggio FM passo. Se fotoconversione avviene, un precipitato marrone scuro è atteso (Figura 1C). Il tempo di illuminazione è variabile, a seconda della illuminazione e forza anche sulla penetrazione DAB nella preparazione. Per la maggior parte preparati, abbiamo trovato i tempi di illuminazione di circa 30-45 minuti per essere ottimale quando si utilizza un obiettivo 20x. Illuminazione periodi più brevi sono utilizzate per gli obiettivi di ingrandimento superiore (60x).
4. Per l'illuminazione preferiamo usare una lampada al mercurio, con una lampada contenente uno specchio posteriore, che raccoglie il back-sparsi fasci di luce, e quindi aumenta l'intensità totale.

5) Elaborazione del campione per EM

1. Osmication
   1. Preparare una soluzione con un volume di tetrossido di osmio albero dei volumi di acqua (circa 300 ml per campione). Lavoro con tetrossido di osmio deve essere fatto sotto il cofano, usando guanti e aye dispositivi di protezione.
   2. Incubare la preparazione della soluzione osmio tetrossido per 1 ora a temperatura ambiente (Sotto il cofano).
   3. Lavare a lungo con PBS (4-5 volte 5 minuti) e trasferire ogni campioni da una bottiglia di vetro pulito.
2. Disidratazione
   1. Preparare soluzioni separate contenenti 30, 50, 70 90, 95 e 100% di etanolo.
   2. Aggiungere 1 ml di etanolo al 30% per ogni campione per 5 minuti.
   3. Aggiungere 1 ml di etanolo al 50% per ogni campione per 5 minuti.
   4. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% per ogni campione per 5 minuti.
   5. Aggiungere 1 ml di etanolo al 90% per ogni campione per 5 minuti.
   6. Aggiungere 1 ml di etanolo al 95% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x).
   7. Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x).
3. Incorporare e l'ulteriore elaborazione
   1. Mescolare 1 volume di Epon resina con un volume di etanolo. Aggiungerlo alla preparazione in rotazione continua (2-4 ore).
   2. Mettere il preparato in Epon 100% in flaconi aperti, lasciare evaporare l'etanolo residuo (4-6 ore).
   3. Mettere il preparato in stampi a 60 ° C per 36 ore.
   4. Microscopia elettronica di elaborazione. Processo di preparazione nel 50-80 nm sezioni sottili, utilizzando le procedure ultramicrotomy standard.
4. Microscopia elettronica a immagini
   1. La preparazione è ripreso con i convenzionali procedure di EM.

6) Rappresentante Risultati

I risultati attesi sono descritti nelle figure 1C e 2. L'illuminazione risultati della procedura nella formazione di brown precipitare DAB, che sarà visibile sia in fluorescenza e di imaging di trasmissione. Il verificarsi prima durante illuminazione è la scomparsa della fluorescenza associata alla colorazione colorante FM. La fluorescenza di fondo indotto dalla fissativo aldeide, al contrario, sarà visibile in tutto l'esperimento. Lo sbiancamento avviene di solito in ~ 10-20 minuti dopo l'inizio di illuminazione. Tipicamente nessun prodotto fotoconversione può osservare a questo punto del tempo.

L'illuminazione deve essere continuato, e dopo ~ 10 minuti i preparativi si trasformi in una tonalità marrone a causa di accumulo di DAB (Fig. 1C _iv) Non è chiaro perché le precipitazioni DAB e FM colorante sbiancamento non avvengono simultaneamente, è possibile che una relativamente grande quantità di DAB ossidato ha bisogno di accumulare prima di aggregazione e precipitazione, e che quindi questa reazione è più lento il processo di sbiancamento. In questa fase, tuttavia, il preparato non è pronto per l'elaborazione di microscopia elettronica, come la precipitazione DAB è probabilmente incompleto. Noi preferiamo aspettare 5-10 minuti più lunghi, durante i quali la preparazione (terminale nervoso presinaptico) assume un colore marrone scuro (o nero) a colori, indicativo di completa conversione. Una conversione leggera della superficie generale della preparazione (per esempio, delle fibre muscolari in una giunzione neuromuscolare) si possono osservare in questa fase. E 'molto probabilmente legati alla conversione del DAB indotta da autofluorescenza (e / o fluorescenza fissativo), e non è dannoso per la procedura.

La preparazione viene poi elaborato per la microscopia elettronica, e devono essere controllati per la presenza di buio (con etichetta) vescicole. Come abbiamo dimostrato prima di ^5,6, queste vescicole sono molto più denso non etichettati quelli, e sono quindi facilmente distinguibili (Figura 2B). Per aumentare la possibilità di distinguere bene i diversi tipi di vescicole, nessun contrasto di miglioramento colorazione posto di sezioni deve essere eseguita (non acetato di uranile o citrato di macchie di piombo), la colorazione osmio è sufficiente osservare elementi più cellulari, e non è così scuro come precipitare DAB.

Figura 1: coloranti FM e lo uso per fotoconversione. (A) Rappresentare le fasi di un esperimento classico per il carico e sequestro vescicole usando colorante FM sotto stimolazione. (I) Incubare il campione in FM colorante contenente tampone. (Ii) Stimolare (elettricamente o chimicamente) per indurre la fusione delle vescicole in presenza di FM colorante. (Iii) Il endocitosi sottosuccessione dopo la stimolazione verrà caricato alcune vescicole con colorante FM ancora presenti nel buffer extracellulare. (Iv) Sostituire il colorante extracellulare FM con il lavaggio con soluzione tampone. (V) Un nuovo stimolo indurrà vescicole caricato per liberare la loro tintura FM su esocitosi. (B) Schema che mostra il, ponte di testa e la coda della FM1-43 colorante. (C) Esempio di un esperimento fotoconversione in Drosophila NMJ. (I) Dopo aver caricato il NMJ con FM1-43, il lavaggio esterno molecole di colorante e di fissaggio, la fluorescenza di una terminazione nervosa può essere osservato con un microscopio convenzionale epifluorescenza (63x). (Ii-iii) Sotto illuminazione continua il colorante è completamente imbiancato. (Iv) In condizioni di illuminazione continua, un colore nero sembra a causa di precipitazioni diaminobenzidina. Barra di scala rappresenta 10 micron.

Figura 2: EM esempi di campioni photoconverted (A) L'immagine mostra un terminale nervose contenenti vescicole sinaptiche, ma non di loro sono photoconverted, questo potrebbe essere causato da non avere un'illuminazione sufficiente o scarsa penetrazione diaminobenzidina nel tessuto.. (B) bouton Synaptic con diversi scura (piena) vescicole che ha attraversato fotoconversione FM. (C) Eccesso di risultati illuminazione in un terminale complessivo buio dove non vescicole o organelli sono distinguibili. Barre di scala rappresentano 200 nm.

A few critical steps should be taken into account:

• The DAB incubation should be performed only after thorough washing and quenching of the preparations. Otherwise the non-reacted glutaraldehyde will interact with DAB and cause its precipitation (typically in the form of flat crystals, which are not electron dense). Preparations where this precipitation takes place abundantly are rarely usable for electron microscopy.
• Illumination times should be optimized, by testing several identical preparations with different illumination times. In our experience, optimal conversion (Figure 2B) is achieved in a time window of about 5 minutes (for example, between 35 and 40 minutes after the start of illumination). Insufficient illumination (Figure 2A) is characterized by a lack of labeled organelles, and/or partially labeled organelles (such as vesicles appearing to contain DAB in only half of their volume). Long illumination, in contrast, results in over-conversion the DAB conversion product accumulates, distorts the organelles and escapes into the cytosol (Figure 2C). The preparations appear as black structures in electron microscopy, with little observable morphology.

We have used the technique in several preparations, including neuromuscular junctions from Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, zebrafish (Danio rerio) and frog (Rana pipiens and Rana esculenta). We have also used the technique in cultured cells, including cultured neurons and neuroendocrine cells. It can also be used successfully in purified synapses from rat brain (synaptosomes). Therefore, we expect the technique to be usable in most preparations which use vesicular membrane uptake.
The technique it is the most sensitive technique to date in determining the positioning and morphology of endocytosed organelles. It was used to determine the exact location of recently endocytosed organelles, including specific physiological pools of vesicles ^5,6,7,8. It has also been used in determining the number and morphology of the organelles in the recycling pathway see for example ^9,10.