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Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

DOI:

10.3791/1846

October 29th, 2010

In This Article

Summary

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Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Abstract

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Cristallografia elettroni si è evoluto come un metodo che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con tridimensionale cristallizzazione e cristallografia a raggi X per lo studio struttura-funzione domande di proteine ​​di membrana, così come proteine ​​solubili. Screening per bidimensionali (2D) i cristalli di microscopia elettronica a trasmissione (EM) è un passaggio fondamentale nella ricerca, l'ottimizzazione e selezione dei campioni ad alta risoluzione di raccolta dati da Cryo-EM. Qui si descrivono le tappe fondamentali nell'identificazione grandi e ordinato, così come piccoli array 2D, che possono potenzialmente fornire informazioni critiche per l'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione.

Grazie alla collaborazione con diversi ingrandimenti a EM, dati su una serie di parametri critici si ottiene. Ingrandimento inferiore fornisce dati preziosi sulle dimensioni e morfologia della membrana. A maggiore ingrandimento, dimensioni possibili cristallo ordine e 2D sono determinati. In questo contesto, è descritto come CCD e online-trasformate di Fourier sono utilizzati a più alto ingrandimento per valutare proteoliposomi per l'ordine e la dimensione.

Mentre cristalli 2D di proteine ​​di membrana sono più comunemente coltivate mediante ricostituzione con la dialisi, la tecnica di screening è ugualmente applicabile per i cristalli di prodotto con l'aiuto di monostrati, nativo cristalli 2D, e ha ordinato gli array di proteine ​​solubili. Inoltre, i metodi qui descritti sono applicabili alla proiezione di cristalli 2D di ancora più piccoli così come proteine ​​di membrana più grande, dove proteine ​​più piccole richiedono la stessa quantità di cura per l'identificazione come il nostro esempio e il reticolo di proteine ​​più grandi potrebbero essere più facilmente identificabili nelle prime fasi dello screening.

Protocol

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1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D

  1. Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto 1. Per la preparazione veloce di un gran numero di griglie da utilizzare per lo screening dei processi di cristallizzazione 2D, una versione modificata di colorazione nega....

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Discussion

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Corretta valutazione dei campioni esige un'attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l'ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D 7.

Quando precipitazione delle proteine ​​si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l'ispezione a basso ingrandimento, anc.......

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Acknowledgements

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Ringraziamo i nostri collaboratori per la fornitura di campioni di proteine ​​di valore, che ha contribuito ad alcune delle nostre esperienze e le osservazioni relativi metodi. Günther Schmalzing gentilmente fornito l'opportunità di FR di aderire a questo progetto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills Si ringraziano per il loro aiuto eccezionale e di ingresso delle apparecchiature. Il finanziamento è stato fornito dal NIH concedere HL090630.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Griglie TEM in rame da 400 maglie rivestite con
: regolari e anticapillari Dumont #5 e Dumont N5AC o simili
Micropipette e puntali
Carta da filtro
uranile all'1%
Campione di dialisi da sottoporre a screening 2D
dialisi senza glicerolo/saccarosioMicroscopio
elettronico a trasmissione (TEM) JEOL-1400 opzionalesimile80 – 120kV TEM dotato di un filamento Lab6 o di tungsteno e di telecamere a pellicola e/o CCD (telecamere CCD Gatan Orius SC1000 e/o UltraScan1000 e pacchetto software Gatan Digitial Micrograph o telecamere Tietz (TVIPS))
pinze a film di carbonioper pipetteWhatman #4Acetato diTampone per

References

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  1. Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
  2. Schmidt-Krey, I. Electron crysta....

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Electron CrystallographyTwo dimensional CrystallizationMembrane ProteinsTransmission Electron MicroscopyCryo EMProteoliposomesNegative StainingOnline Fourier TransformCCD CameraCrystal Screening

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