Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.
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Articolo metodologico
Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cristallografia elettroni si è evoluto come un metodo che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con tridimensionale cristallizzazione e cristallografia a raggi X per lo studio struttura-funzione domande di proteine di membrana, così come proteine solubili. Screening per bidimensionali (2D) i cristalli di microscopia elettronica a trasmissione (EM) è un passaggio fondamentale nella ricerca, l'ottimizzazione e selezione dei campioni ad alta risoluzione di raccolta dati da Cryo-EM. Qui si descrivono le tappe fondamentali nell'identificazione grandi e ordinato, così come piccoli array 2D, che possono potenzialmente fornire informazioni critiche per l'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione.
Grazie alla collaborazione con diversi ingrandimenti a EM, dati su una serie di parametri critici si ottiene. Ingrandimento inferiore fornisce dati preziosi sulle dimensioni e morfologia della membrana. A maggiore ingrandimento, dimensioni possibili cristallo ordine e 2D sono determinati. In questo contesto, è descritto come CCD e online-trasformate di Fourier sono utilizzati a più alto ingrandimento per valutare proteoliposomi per l'ordine e la dimensione.
Mentre cristalli 2D di proteine di membrana sono più comunemente coltivate mediante ricostituzione con la dialisi, la tecnica di screening è ugualmente applicabile per i cristalli di prodotto con l'aiuto di monostrati, nativo cristalli 2D, e ha ordinato gli array di proteine solubili. Inoltre, i metodi qui descritti sono applicabili alla proiezione di cristalli 2D di ancora più piccoli così come proteine di membrana più grande, dove proteine più piccole richiedono la stessa quantità di cura per l'identificazione come il nostro esempio e il reticolo di proteine più grandi potrebbero essere più facilmente identificabili nelle prime fasi dello screening.
Protocollo
1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D
- Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto 1. Per la preparazione veloce di un gran numero di griglie da utilizzare per lo screening dei processi di cristallizzazione 2D, una versione modificata di colorazione nega....
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Discussione
Corretta valutazione dei campioni esige un'attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l'ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D 7.
Quando precipitazione delle proteine si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l'ispezione a basso ingrandimento, anc.......
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Ringraziamenti
Ringraziamo i nostri collaboratori per la fornitura di campioni di proteine di valore, che ha contribuito ad alcune delle nostre esperienze e le osservazioni relativi metodi. Günther Schmalzing gentilmente fornito l'opportunità di FR di aderire a questo progetto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills Si ringraziano per il loro aiuto eccezionale e di ingresso delle apparecchiature. Il finanziamento è stato fornito dal NIH concedere HL090630.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Griglie di rame TEM a 400 mesh rivestite con film di carbonio | |||
| Pinze: normali e anti-capillari | Dumont #5 e Dumont N5AC o simili | ||
| Pipetta microlitrica e punte per pipetta | |||
| Carta filtro Whatman #4 | |||
| Acetato di uranile al 1% | |||
| Campione di dialisi da esaminare per cristalli 2D | |||
| Tampone di dialisi privo di glicerolo/saccarosio | Facoltativo | ||
| Microscopio elettronico a trasmissione JEOL-1400 (TEM) | TEM simile da 80 – 120 kV dotato di filamento a Lab6 o tungsteno e pellicola e/o telecamere CCD (Gatan Orius SC1000 e/o telecamere CCD UltraScan1000 e pacchetto software Gatan Digital Micrograph o telecamere Tietz (TVIPS)) |
Riferimenti
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crysta....
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Ristampe e permessi
