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Espressione della proteina in Pichia pastoris microbica eucariotica ospitante offre la possibilità di generare elevate quantità di proteina ricombinante in un sistema di espressione veloce e facile da usare.
Come un microrganismo unicellulare P. pastoris è facile da manipolare e cresce rapidamente su un supporto economico a densità elevata delle cellule. Essendo un eucariote, P. pastoris è in grado di eseguire molte delle modificazioni post-traduzionali eseguiti dai maggiori cellule eucariotiche e le proteine ricombinanti ottenuti subiscono ripiegamento delle proteine, maturazione proteolitica, la formazione di legame disolfuro e glicosilazione [1].
Come un lievito P. methylotrophic pastoris è in grado di metabolizzare metanolo come unica fonte di carbonio. Il promotore forte per l'alcol ossidasi, AOX1, è strettamente regolato e indotta da metanolo ed è utilizzato per l'espressione del gene di interesse. Di conseguenza, l'espressione della proteina estranea può essere indotta con l'aggiunta di metanolo al mezzo di crescita [2, 3].
Un altro vantaggio importante è la secrezione della proteina ricombinante nel mezzo di crescita, utilizzando una sequenza segnale per indirizzare la proteina estranea al via secretoria di P. pastoris. Con solo i bassi livelli di proteina endogena secreta alla stampa dallo stesso lievito e senza proteine aggiunti ai media, una proteina eterologa costruisce la maggior parte delle proteine totali nel medio e facilita le seguenti fasi di purificazione proteica [3, 4].
Il vettore usato qui (pPICZαA) contiene il promotore per AOX1 strettamente regolamentati, metanolo-indotta espressione del gene di interesse, il fattore-α segnale di secrezione per la secrezione della proteina ricombinante, un gene di resistenza Zeocin per la selezione sia in E. coli e Pichia e un C-terminale del peptide contenente il c-myc e un epitopo (6xHis) tag polyhistidine per il rilevamento e la purificazione di una proteina ricombinante. Mostriamo anche l'analisi western blot della proteina ricombinante utilizzando lo specifico anti-myc HRP-anticorpo che riconosce il c-myc epitopo sul vettore genitore.