Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Sommario

Questo video mostra la tecnica utilizzata per la preparazione di organizzatore e di espianti polo animale da embrioni di Xenopus laevis, compreso l'uso del coltello sopracciglio - uno strumento specializzato in dissezione della propria sopracciglio. Il protocollo per l'assemblaggio di un test di adesione è data anche, che le sonde per la presenza di molecole di adesione chiave presenti sulla superficie o organizzatore cellule polo animale che sono fondamentali per un corretto sviluppo.

Protocollo

Preparazione Chambers Adesione (il giorno prima l'iniezione / dissezione)

Adesione saggio Chambers

Se si dispone di un microscopio convenzionale composto (localizza ottica sopra il palco), è ncecessary fare una bassa altezza camera di adesione come segue. Se si utilizza il microscopio invertito-ottica, poi "NUNC Lab-Tek vetrino Chambered" può solo essere usato, e saltare i passaggi # 1 - 2.

1. Collegare uno dei "press-per sigillare-isolante silicio" su un 24 millimetri x 40 vetrino. Premere con decisione l'isolatore allo scorrimento coperchio sul banco di lavoro pulito e guardare dall'altra parte per assicurarsi che l'isolante sia completamente inserito, senza bolle d'aria.
   
   
2. Optional: Mettere le camere adesione in un piatto di vetro Petri con carta Whatman filtro e autoclave a secco a ciclo per la sterilizzazione. Raffreddarli a RT.

Rivestimento della Camera

1. Mettere una goccia da 200 ml di soluzione di lavoro di caderina (10 mg) o fibronectina (20mg/ml) sul centro di una camera di adesione in autoclave, utilizzando sigmacoated punte gialle. Incubare a temperatura ambiente per 4 ore.
   
   
2. Estrarre la soluzione caderina o fibronectina e trasferirli in un tubo di 1,5 ml. Questa soluzione può essere riutilizzati per successive due settimane.
   
   
3. Dispensare 500 ml del 4% BSA in 1x MBS-H per bloccare la camera. Incubare a RT per 1 ora.
   
   
4. Aspirare la soluzione di BSA. Lavare la camera con 500ml di 1x MBS-H due volte. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte di MBS-H (non completamente), e conservare in un contenitore sigillato a 4 ° C. Questa camera di adesione è un bene per i prossimi 2 - 3 giorni.

Dissezione e dissociazione di espianti Cap Animale

1. Incubare gli embrioni iniettati in 0.1x MBS-H, diluito in base al autoclave 1x MBS-H, in quanto non in autoclave medio porta a volte piccoli germi che possono disturbare il dissociato cellule tappo animali.
   
   
2. Fai 1x Barth agarosio piatti e CMF-MBS piastre di agarosio con piatti 60mm, almeno tante quanto il numero dei tuoi campioni. Versare autoclave 1x MBS-H per le piastre 1x Barth. Per CMF-MBS piatti, versare 10 ml di CMF-MBS.
   
   
3. Quando gli embrioni diventano palcoscenico 8,5, avviare sezionare i tappi animale in lamiera uno Barth 1x è. 10-15 espianti per i campioni sono di solito sufficienti per un esperimento.
   
   
4. Trasferire il espianti animali tappo ad un CMF-MBS piatto. Incubare la espianti per 45 - 60 minuti fino a quando la espianti sono completamente dissociati. Agitazioni delicato in ogni 15 minuti aiuterà la dissociazione.

Adesione cellulare Assay

1. Semina delle cellule: Dispensare 500 ml di 1x MBS-H alla camera di adesione preparati nella procedura descritta nelle sezioni di cui sopra, Chambers Assay Adesione e rivestimento della Camera. Trasferire il dissociato cellule animali tappo dalla CMF-MBS piastra alla camera di adesione utilizzando P200 con punte sigmacoated e tritate-off giallo.
   
   
2. Facoltativo: se possibile, con attenzione succhiano il supporto fino a circa 2 / 3 a metà strada, senza esporre le cellule all'aria. Aggiungere circa la stessa quantità di fresco MBS-H, per assicurarsi che il terreno contiene sufficiente Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   
   
3. Incubare a RT per 45 - 90 minuti. Controllare le cellule di tanto in tanto per vedere se sono connessi con la superficie inferiore.
   
   
4. Ora è possibile scattare la foto delle cellule al microscopio.
   
   
5. Porre la camera di adesione su un vetrino griglia. Allineare uno degli angoli della camera di adesione a un angolo della diapositiva griglia. Contare e registrare il numero delle cellule allegata in varie griglie.
   
   
6. Versare 1L di MBS-H in un secchio di plastica di grandi dimensioni (ad esempio, Tupperware, ecc.) Delicatamente la camera di scorrimento adesione al fondo del secchio. Ruotare sul agitatore orbitale per cinque minuti a bassa velocità (50 - 60rpm).
   
   
7. Porre la camera di adesione indietro sulla griglia di scorrimento, allineando stesso angolo della camera verso l'angolo della diapositiva stessa griglia, come è stato fatto nel punto # 5 del presente, di analisi cellulare sezione Adesione. Conta il numero di cellule che rimangono attaccati sulla stessa griglia che avete contato prima del lavaggio. Calcolare la percentuale di cellule che rimangono attaccati dopo il lavaggio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x MBS-H	Tampone			Barth modificato’s medio: ricetta per 1 L: 5,14 g di NaCl, 75 mg di KCl, 0,2 g di NaHCO₃3 0,2 g di MgSO₄4•7H2O 60 mg di CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.
CMF-MBS	Tampone			Questo è Ca2+/Mg2+-versione libera di MBS-H. Ricetta per 500 mL: 2,57 g di NaCl, 37,5 mg di KCl, 0,1 g di NaHCO₃3/sub> 1,19 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.
1% agarosio/1x Barth’piastre s				tanti quanti sono i campioni
Piastrine di agarosio 1% in CMF-MBS				tanti quanti sono i campioni
E-Cadherina/Fc chimera	Reagente	Sigma-Aldrich	E-2278	Sciogliere 0,1 mg di E-caderina solida in 100 µl di MBS-H 1x contenente il 40% di glicerolo per ottenere una soluzione madre 100x (1,0 mg/ml). Conservare in –20 °C. Prima dell'uso, preparare una diluizione 1/100 con MBS-H 1x per ottenere una soluzione lavorativa da 10 μg/ml. Sono necessari 200 μl di questa soluzione lavorativa per ogni campione.
Fibronectina, soluzione allo 0,1%	Reagente	Sigma-Aldrich	F-1141	Questa soluzione pronta all'uso può essere utilizzata come soluzione madre 50x. Eseguire una diluizione 1:50 con MBS-H 1x per ottenere 20 μsoluzione lavorativa g/mL subito prima dell'uso. Sono necessari 200 μL per campioni di questa soluzione lavorativa. NON consiglio di utilizzare Fibronectina solida, poiché è difficile da sciogliere alla concentrazione dello 0,1% per preparare la soluzione madre. Anche se più costosa, questa soluzione pronta all'uso allo 0,1% è preferibile per ottenere risultati costanti.
4% BSA / MBS-H	Tampone			BSA: frazione V di grado biologia molecolare
punte gialle Sigmacoted	Strumento
Coprioggetti n.1				40 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm
Isolante in silicone con chiusura a pressione	Strumento	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2,5 mm di profondità x 20 mm di diametro
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Strumento	Fisher Scientific	12-565-471	2 pozzetti/vetrini
Vetrino portaoggetti a griglia	Strumento			o reticolo del Finder per il conteggio cellulare