Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l'embriogenesi.
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Articolo metodologico
Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell'immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule cambiare ampiamente nelle loro posizioni e proprietà durante l'embriogenesi. Questi cambiamenti sono regolati dalle interazioni tra le cellule e il loro ambiente. Embrioni chimerici, che sono composti da cellule di diverso background genetico, sono grandi strumenti per studiare le interazioni cellula-cellula mediata da geni di interesse. La trasparenza embrionale del pesce zebra in primi stadi di sviluppo permette la visualizzazione diretta della morfogenesi dei tessuti e organi a livello cellulare. Qui, dimostriamo un protocollo per generare retine chimerico e cervelli in embrioni di zebrafish e di eseguire l'imaging dal vivo delle cellule del donatore. Il protocollo riguarda la preparazione di aghi trapianto, il trapianto di GFP che esprimono blastomeri donatore per GFP-negativi padroni di casa, e l'esame del comportamento delle cellule del donatore vivo sotto microscopia confocale. Con lievi modifiche, questo protocollo può essere usato anche per studiare lo sviluppo embrionale di altri tessuti e organi in zebrafish. I vantaggi di usare buone pratiche agricole per le cellule del donatore etichetta vengono anche discussi.
Protocollo
Giorno 1. Preparazione
1. Impostare croci pesce
Impostare attraversa coppie di pesce zebra in serata. Per evitare accoppiamenti casuali prima che il tempo desiderato, utilizzare divisori per separare i pesci femminili e maschili nei cassetti di accoppiamento. GFP-esprimere i pesci transgenici sono usati come fonte di blastomeri donatore. Il pt104 linea transgenica (Zou et al., 2008), qui utilizzato, esprime GFP ubiquitariamente sotto il controllo del promotore EF1. Espressione GFP permette la visualizzazione di cellule del donatore per immagini dal vivo. Altre linee di pesci transgenici che esprimono prote....
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Discussione
In questo video, si dimostra un metodo per blastomero trapianto di analizzare lo sviluppo della retina e del cervello in zebrafish. Questo protocollo può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organi e tessuti, semplicemente rilasciando il blastomeri donatore di posizioni corrispondenti negli embrioni di accoglienza. L'etichettatura con le molecole GFP produce uno sfondo più pulito rispetto etichettatura con colorante fluorescente coniugato Destrano (Ho e Kane 1990). Questo perché i residui di c.......
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Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da una National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) ei fondi di seguito per XW: NIH Concessione R01EY016099 e della Ricerca per la prevenzione Career Development Award cecità. Ringraziamo Lathrop Kira per l'assistenza nel campo dell'imaging confocale.
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Materiali
E3 uovo acqua:
- 5 mM NaCl
- 0,17 mM KCl
- 0,33 mM CaCl 2
- 0,33 mM MgSO 4
- Blu di metilene 0,1%
Riferimenti
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). TH....
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Ristampe e permessi
