Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Parte 1: Procedura sperimentale

Dati video contengono un'abbondanza di informazioni. Tuttavia, queste informazioni sono spesso difficili da estrarre e quando è fatto manualmente da esseri umani e può richiedere molte ore di tempo per completare il personale. Analisi manuale da parte dell'uomo è anche soggetto a variazioni d'interpretazione e di errore. Video bioinformatica prevede l'utilizzo di software per estrarre dati specifici da immagini video. Questo metodo di analisi è rapida e può eliminare l'errore che si verifica quando l'analisi viene effettuata manualmente dagli esseri umani. Lo scopo di questo articolo è di dimostrare un metodo per quantificare la crescita delle cellule umane embrionali staminali colonia utilizzando un metodo video di bioinformatica.

In questo lavoro, lasso di tempo le immagini video sono stati raccolti utilizzando una Nikon BioStation unità di incubazione TC, che consente più campi di cellule per essere ripreso nel corso del tempo (Fig. 1). I metodi descritti in questo rapporto sono applicabili ai dati video raccolti da qualsiasi video microscopiche costituito.

Nel nostro disegno sperimentale, abbiamo placcato H9 hESC in lastre di tessuto di 12 e cultura per 48 ore. Durante questo intervallo, le colonie sono stati autorizzati a fissare pienamente e diffusione su Matrigel. Poi, le piastre con colonie hESC allegato sono stati trasferiti al CT BioStation e incubate per altre 48 ore. Mentre nel BioStation, le immagini delle colonie sono stati raccolti a 7 intervalli di un minuto e successivamente sono state utilizzate per creare time-lapse sequenze video. Video per ogni colonia sono stati poi analizzati per quantificare la crescita colonia utilizzando video ricette bioinformatica sviluppata con il CL-Quant software. L'analisi effettuata utilizzando ricette create con la CL-Quant software sono stati controllati per veridicità manualmente utilizzando Adobe Photoshop.

Parte 2: Preparazione delle colonie hESC allegato

1. Crescere hESC su Matrigel rivestito da 6 pozzetti, e una volta confluenza del 70% è raggiunto, replate un pozzetto del 6 pozzetti in 5 pozzetti di una 12-pozzetti Matrigel rivestito come segue.
2. Aspirare il terreno da un pozzetto contenente hESC.
3. Sciacquare bene 2x con 1 ml di PBS.
4. Aggiungere 1ml di Accutase e incubare per 1 minuto a 37 ° C e 5% di CO _2.
5. Aggiungere 10-12 perle di vetro nel pozzo e agitare delicatamente la piastra fino colonie completamente staccare dal fondo del pozzo.
6. Neutralizzare Accutase utilizzando 1ml di mTeSR medio o medio MEF condizionata.
7. Centrifugare la sospensione di cellule in una provetta 15 ml conica a 200g per 3 minuti.
8. Decantare il surnatante e il pellet rottura con 500μl di media mTeSR fresca.
9. Piastra 100μl goccia a goccia della sospensione hESC in ciascun pozzetto in un 12-pozzetti.
10. Piastra oscillare avanti e indietro con delicatezza e osservare le culture sotto un microscopio ottico. Assicurarsi che grumi di cellule sono distribuite uniformemente in tutto il piatto.
11. Posizionare il 12-e piastra posteriore in incubatrice.
12. Lasciare hESC per collegare e far crescere per 48 ore (un tempo più breve può essere utilizzato).
13. Dopo 48 ore, pozzi decantare il supporto e lavare con 500ul di PBS per rimuovere le cellule senza legami.
14. Aggiungere 1 ml di medium mTeSR in ciascun pozzetto.
15. Commento: Collocare immediatamente la piastra nell'incubatore / microscopio per le immagini video.
16. Iniziare a raccogliere le immagini time-lapse. Provare a selezionare i campi con discrete singole colonie che non sono suscettibili di trasformarsi in altre colonie.
17. Altri metodi per la coltura e la creazione di hESC può essere usato al posto del protocollo di cui sopra.

Parte 3: Video Bioinformatica

CL-Quant software è stato utilizzato per creare tre "ricette" che se eseguito in sequenza determinerà il numero di pixel o area in micron per ogni colonia nel tempo. Le tre ricette sono costruiti in sequenza e per questa applicazione sono segmentazione, la valorizzazione e la misurazione.

Analizzando colonia crescita hESC con il CL-Quant software / sviluppo ricetta:

1. La ricetta segmentazione è creato per primo.
2. Scansione l'intero video per assicurarsi che il video è utilizzabile. Verificare che l'intera colonia rimane nel campo di vista e che altre colonie non entrare nel campo.
3. Aprire la procedura guidata di segmentazione e cliccare sul pulsante "Avanti".
4. Selezionare il canale corretto immagine (cioè, la fase, verde, rosso, ecc) e cliccare sul pulsante "Avanti".
5. Pick "corrispondenza soft" dei 3 scelte e fare clic su "Avanti".
6. Selezionare "vogliono" regioni cerchiando regioni sull'immagine tipicamente il bordo esterno della colonia per la zona centrale della colonia.
   • Questa zona dovrebbe essere il più piccolo possibile, ma deve essere rappresentativo dell'intera colonia.
   • Quando si usa il microscopio a contrasto di fase, essere sicuri di includere l'alone intorno alla colonia per la selezione colonia preciso dal software.
   • Scegli 1 o 2 regioni di interesse che possono mostrare diversimodelli di pixel all'interno della colonia, ma non prendere troppi "vuole" che può comportare l'applicazione della maschera inesatte.
7. Fare clic sul pulsante "Avanti".
8. Selezionare "Non voglio" regioni cerchiando regioni sull'immagine che non fanno parte della colonia e non fanno parte dello sfondo. Si tratta di regioni che hanno modelli che si desidera eliminare e comprendono pixel di artefatti come detriti e cellule morte. Fare clic su "Avanti".
9. Selezionare "sfondo" cerchiando regioni si vuole sopprimere.
   • Il "non vogliono" e "sfondo" delle regioni che si differenziano per sfondo deve essere uniforme e probabilità di presentarsi in ogni fotogramma.
   • Di solito ci selezionare lo sfondo grigio intorno alla colonia.
10. Fare clic sul pulsante "Avanti".
11. Una maschera colorata deve essere visualizzato sopra la vostra regione di interesse (Fig. 2A).
12. Se la maschera non copre con precisione la regione di interesse, la gamma soglia di segmentazione (che si trova nell'angolo inferiore destro del display del software) può essere aumentata o diminuita.
13. La procedura guidata di segmentazione richiede un'ulteriore messa a punto della maschera bene, se necessario.
14. Se si desidera cambiare la maschera, selezionare "aggiornamento morbido regioni corrispondenti". Questo consente di modificare il "voglio", "non vogliono", o "fondo" aree.
15. Se la maschera è soddisfacente, selezionare "soglia di applicare e salvare la mia maschera", e cliccare sul pulsante "Avanti".
16. La maschera verrà quindi visualizzato in un colore diverso.
17. Selezionare "Fine".
18. La ricetta dovrebbe essere visualizzata nell'angolo superiore destro del software, e dovrebbe essere chiamato "ricetta segmentazione".
19. Rinominare la ricetta se volete facendo clic destro e "rinomina".
20. Per la verifica in loco, fare clic destro e posizionare il mouse su "applica ricetta".
21. Un menu mostrerà che consente di selezionare il numero di fotogrammi che si desidera utilizzare quando si macchia il controllo della ricetta. Eseguire la ricetta per ogni 10 fotogrammi al controllo in loco l'accuratezza del posizionamento maschera.
22. Se la maschera prende le parti di piccole regioni indesiderate o detriti, è possibile creare una "ricetta miglioramento" per migliorare montaggio della maschera per la regione di interesse.
23. Per creare una ricetta di miglioramento, fate clic destro la "ricetta valorizzazione" cartella, quindi fare clic su "nuovo". Una ricetta nuova valorizzazione dovrebbe essere visualizzato.
24. Dal campo di vista originale (FOV), fare clic sul "miglioramento alterna modulo" pulsante che si trova alla destra dell'immagine. Il mouse sulle icone nella barra degli strumenti per identificare quello corretto.
25. Selezionare il menu a discesa "etichettatura".
26. Selezionare "4 etichettatura connessi".
27. Selezionare "etichettatura 4 connected2".
28. Una nuova barra delle applicazioni dovrebbe essere visualizzata.
29. Prendete la maschera iniziale (mask0) dalla ricetta segmentazione e trascinarlo nella casella "input".
30. La barra dovrebbe ora visualizzare "maschera di input #".
31. Trascinare l'icona con la "maschera di input #" per l'icona della maschera 0.
32. Trova "dimensione min" nella barra delle applicazioni e regolare fino a quando il numero unica regione di interesse visualizzati. Assicurati di cliccare su "Esegui" in ogni prova di montaggio.
33. Quando si è soddisfatti con il vostro regolazione dimensioni minime, clicca su "ricetta valorizzazione" che hai creato in precedenza. (Fig. 2B)
34. Nella parte inferiore dello schermo, selezionare "salva di ricetta".
35. Il software richiede ora a "sovrascrivere ricetta selezionata?", Selezionare "sì"
36. Controllo in loco la ricetta valorizzazione utilizzando le stesse procedure di cui sopra per la segmentazione posto di controllo.
37. Se sei soddisfatto delle segmentazione e le ricette degli accessori, selezionare 'creare modelli di misurazione' sulla barra degli strumenti di destra.
38. Rinominare il modello, se volete.
39. Nella finestra modello di misurazione, spostare il cursore sopra la figura di cellule clipart. Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare la cella.
40. Deseleziona 'default il parametro' e 'il parametro area' sotto controllo 'morfologia'.
41. Exit 'modello' finestra.
42. Selezionare l'icona creata nella ricetta di misura.
43. Rinominare la ricetta.
44. Spostarsi e selezionare la scheda 'modello' in alto a destra.
45. Trascinate e rilasciate il modello di misura creato in precedenza nella finestra di misura.
46. Fare clic su 'Sì' per continuare.
47. Nella finestra ricetta di misura, selezionare 'Canale mappature', 'cellula intera' allora.
48. Selezionare 'Maschera mappature'.
49. Poi 'cellula intera' selezionare l'opzione per la maschera avanzata.
50. Selezionare la 'ricetta di misura' sotto la scheda ricetta nella finestra principale.
51. Selezionare l'icona 'Salva' all'interno della finestra ricetta di misura.
52. Quindi chiudere la finestra.
53. Ora, chiudere e riaprire il 'FOV'.
54. Fare clic destro sull'icona 'ricetta', selezionare 'ricetta lista Lock' ed eseguire le ricette in sequenza sui vostri dati video.

Parte 4: Controllo di precisione ricetta utilizzando il software Photoshop

Al fine di validare la ricetta creata con (CL-Quant softwsono), gli stessi dati possono essere analizzati manualmente con Adobe Photoshop. Per questa analisi, ogni fotogramma 10 (ogni 70 punti Tempo min) è stato analizzato per misurare le dimensioni della colonia nell'arco di 48 ore.

1. Aprire una cornice di un'immagine colonia in Adobe Photoshop.
2. Clicca sulla bacchetta magica nella barra degli strumenti.
3. Clicca sulla zona intorno alla colonia modo che il campo è coperto, tranne la regione colonia.
4. Fare clic su 'Modifica in modalità maschera veloce' nella barra degli strumenti e fare clic sulla colonia così la colonia è stata selezionata.
5. Assicurarsi che la linea tratteggiata attorno alla colonia si adatta a destra intorno alla periferia della colonia, e non dentro. Se la linea tratteggiata non è intorno alla periferia, modificare il valore di tolleranza nella barra degli strumenti superiore di conseguenza.
6. Vai alla 'Finestra' menu a tendina e cliccare su 'Istogramma'.
7. Annotare il valore dei pixel quando la cache = 1. Se la cache è di 2, fare clic sul '!' per passare alla cache di 1, e prendere nota del valore del pixel.
8. Ripetere la procedura per ogni fotogramma 10. Un minor numero di frames totali può essere utilizzato se lo si desidera.
9. I dati raccolti con Photoshop e CL-Quant software può quindi essere tracciata insieme. Se il CL-Quant ricette sono veritiere, le curve di Photoshop per l'analisi e CL-Quant dovrebbe essere molto simile (fig. 3-5).
10. Se le ricette sviluppato con CL-Quant sono veritiere, possono essere applicati affidabile ai dati video.
11. Il valore in uso di video bioinformatica in questa analisi è che una volta la segmentazione, la valorizzazione, e le ricette di misura sono stati sviluppati e validati, si esibiranno l'analisi molto più rapidamente e più accuratamente di quanto un essere umano con Photoshop.

Rappresentante Risultati

Figura 1: Film strip di una colonia hESC rappresentare i frame in diversi momenti durante le 48 ore di crescita in un CT BioStation. Cornici sono state prese a 7 ​​minuti.

Figura 2: (A) Immagine di un hESC con una maschera posta sulla colonia dalla ricetta segmentazione. Aree di detriti e lo sfondo sono mascherati anche indicare che una ricetta potenziamento è necessario per migliorare l'accuratezza della valutazione. (B) Immagine della colonia stessa, come indicato in "A" dopo il miglioramento è stato eseguito. La maschera seleziona ora solo la colonia e il rumore è stato eliminato dalla selezione.

Figura 3: Il grafico che mostra aumento delle dimensioni della colonia (in pixel) nell'arco di 48 ore come determinati con CL-Quant software e Photoshop. Questo grafico grafici i dati grezzi e mostra che le colonie partono da diverse dimensioni. Dimostra anche che entrambi i metodi di misura sono in buon accordo.

Figura 4: Il grafico che mostra gli stessi dati come nella figura 3 dopo la normalizzazione di mostrare l'aumento di dimensioni della colonia per cento in più di 48 ore. Questo dimostra che i tassi di crescita sono simili indipendentemente dalla dimensione colonia di partenza e che entrambe le misure di analisi danno risultati simili.

Figura 5: Il grafico che mostra i mezzi per i dati normalizzati in Figura 4. Questo grafico mostra chiaramente un buon accordo tra l'analisi fatta utilizzando video bioinformatica (CL-Quant software) e Photoshop e stabilisce che la ricetta è veritiero. La leggera flessione in area per i dati di Photoshop a telaio 325 è dovuto a diversi video non essere inclusi nell'analisi Photoshop.

Video bioinformatics tools are powerful for rapidly extracting data from video images. Our protocol for quantifying hESC colony growth demonstrates one application of video bioinformatics to a biological problem. This method is quantitative and has the interesting feature of revealing data from individual hESC colonies. Video bioinformatics recipes can be developed to monitor other cellular processes such as proliferation, migration, apoptosis, and cell attachment to the substrate, and cell attachment to adjacent cells. The accuracy of the recipes developed using CL-Quant software was validated using Photoshop and was found to be truthful. Once the appropriate recipes are developed, video data from any source can be analyzed very quickly. The time required to analyze video data using video bioinformatics tools is significantly less than the time needed for analysis performed by hand using Photoshop. Moreover, the analysis done by the computer is less prone to error, as the computer will analyze the data the same way each time, while a human performing an analysis may make errors or slightly different judgments each time an image is analyzed. Although not discussed as part of this protocol, videos can also be examined for morphological changes in the colony. This parameter would be useful in cases where treatment groups are included.