Il cordone ombelicale sono utilizzate per isolare le cellule muscolari lisce per vie diverse. In questo lavoro abbiamo usato il trattamento enzimatico per isolato cellule muscolari lisce.
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Articolo metodologico
Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cordone ombelicale umano (UC) è un campione biologico che può essere facilmente ottenuto solo dopo la nascita. Questo campione biologico è, il più delle volte, scartati e la loro raccolta non comporta alcun rischio aggiuntivo per la salute neonato o la madre s. Inoltre non sono preoccupazioni etiche sollevate. L'UC è composto da una vena e due arterie da cui entrambe le cellule endoteliali (EC)
Protocollo
- Arterie sono ottenuti da pezzi di UC di 3-7 cm.
- Gelatina di Wharton che circonda le arterie è stato accuratamente rimosso tagliandolo con le forbici.
- Un brusco-end ago di un diametro esterno di 0.6-1mm è stato inserito 7 mm circa da una estremità delle arterie sezionato.
- Per rimuovere il sangue residuo all'interno dei vasi, le arterie sono tenute in verticale e perfusi con, circa 20 a 40 ml, soluzione fisiologica (PSS), utilizzando una siringa da 20 ml collegata ad un ago. Se necessario, questa fase di lavaggio è stato ripetuto per diverse volte.
- La stessa procedura è stata ripetuta con RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Una estremità del vaso sanguigno è stato chiuso. Una siringa da 10 ml è stato collegato all'ago e perfusi con 3 ml di collagenasi tipo I (800 unità / ml in soluzione salina tampone di Hank (HBSS)). Poi l'altra extremityof la nave è stata anche chiusa.
- La nave è stata incubata con una soluzione salina tampone fosfato (PBS), per 15 minuti a 37 ° C con agitazione.
- Dopo la fine della nave sono stati tagliati per raccogliere le SMC libero. Le arterie erano profumato con circa 20 a 40 ml di DMEM-F12 integrato con il 5% di FBS e antibiotico ad un tubo da 50 ml.
- Il tubo è stato centrifugato a temperatura ambiente (250 g, 8 min) e pellet cellulare è stato risospeso in 5 ml di DMEM-F12 integrato con il 5% di FBS.
- La sospensione cellulare è stato trasferito in un collagene rivestito T-pallone e incubate a 37 ° C, con un 5% di CO 2 nell'atmosfera umidificata.
- Dopo 5 16 h, la non-aderenti cellule e drebis cellulari sono stati rimossi, 5 ml di terreno di coltura è stata aggiunta e le cellule sono state incubate a 37 ° C, con un 5% di CO 2 nell'atmosfera umidificata.
- I mezzi di coltura cellulare era cambiato ogni 2 3 giorni, fino a raggiungere SMC confluenza.
- Dopo aver raggiunto confluenza le cellule sono state seminate in due o tre 25 cm 2 T-fiaschi.
Pulizia
- Smaltire gli aghi in un contenitore taglienti.
- Smaltire le siringhe in grandi contenitori a rischio biologico.
- Mettere tutto il tessuto in una piccola borsa a rischio biologico. Chiudere il sacchetto e congelare a -20 ° C fino a quando l'incenerimento.
- Immergere tutti gli strumenti in virucida per almeno 10 min.
- Ritorna supporti non utilizzati per frigorifero.
- Smaltire i guanti in rifiuti biologici.
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Discussione
Le SMC possono essere utilizzati come modelli per i test futuri con farmaci constrictor, di isolare e caratterizzare strutturalmente di tipo L canali del calcio, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari della funzione vascolare e di utilizzarli in ingegneria dei tessuti. SMC e EC sono fondamentali per lo sviluppo di nuovi biomateriali che possono essere utilizzati per la produzione di semi vasi sanguigni sintetici da utilizzare negli esseri umani.
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Ringraziamenti
Ospedale Amato Lusitano, Castelo Branco in Portogallo.
Ospedale Sousa Martins, Guarda il Portogallo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Serum bovino fetale (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagene | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotico | 10 μL/ 1 mL di mezzo | ||
| Forbici | Sterilizzate | ||
| Ago | Diametro di 0,6-1 mm | ||
| Siringa | 10 - 20 mL | ||
| Soluzione fisiologica salina (PSS) | 20-40 mL per arteria | ||
| Collagenasi tipo I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per arteria |
| Soluzione salina tampone di Hank’s (HBSS) | Collagenasi diluita | ||
| Soluzione salina tampone al fosfato (PBS) | Scaldata a 37°C |
Riferimenti
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
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Ristampe e permessi
