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Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Disposizione e la Raccomandazione Generale della Legislazione Cinese sull'Amministrazione degli Animali da Sperimentazione e sono stati approvati dall'Institution of Animal Care and Use Committee della Capital Medical University (Rif. n. AEEI-2014-052). Sono stati utilizzati topi femmina Balb/c di età compresa tra 6 e 8 settimane.
1. Preparazione delle cellule e degli animali
- Un giorno prima dell'operazione, radere i peli intorno ai quarti capezzoli per esporre l'area operatoria.
- Usa una mano per tenere saldamente il mouse sul retro per assicurarti che il mouse non si muova liberamente, alza il mouse per esporre la pancia all'operatore, quindi usa un'altra mano per radere il pelo attorno ai quarti capezzoli con un rasoio elettronico.
- Metti uno strato sottile di crema depilatoria intorno ai capezzoli per 30-60 s, pulisci la crema con acqua distillata, quindi asciuga il topo con carta morbida.
- Il giorno dell'operazione, raccogliere le cellule di carcinoma mammario murino (4T1-luc2), contare il numero di cellule e regolare la densità cellulare a 2 x 105 cellule/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in provette sterili per microcentrifuga e tenerle in ghiaccio. Per ogni topo viene preparata 1 x 104 cellule/50 μL in una siringa da 1 mL.
2. Iniezione ortotopica
- Anestesia dei topi
- Indurre l'anestesia. Metti i topi in un contenitore trasparente chiuso e accendi il gas isoflurano al 2% per anestetizzare i topi per circa 5 minuti, fino a quando non si sdraiano e si addormentano.
- Mantenere l'anestesia. Trasferire i topi dal contenitore alle maschere per anestesia individuali, mettere un po' di unguento veterinario sugli occhi per evitare secchezza, tenere i topi supini con i capezzoli esposti all'operatore e lasciarli continuare a inalare il gas isoflurano per alcuni minuti fino a quando l'iniezione non è stata eseguita.
- Confermare il successo dell'anestesia dalla mancanza di un riflesso di ritiro del pizzicamento delle dita dei piedi.
- Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza oculare.
NOTA A seconda delle dimensioni del contenitore e del numero di maschere per anestesia individuali disponibili, un gruppo di topi può essere anestetizzato insieme e iniettato uno per uno in anestesia individuale.
- Prestazioni dell'iniezione
- Usa una mano per tendere la pelle intorno al quarto capezzolo con una pinzetta, per creare un "tunnel" sollevato che la siringa deve seguire. Utilizzare l'altra mano per tenere la siringa con l'ago rivolto verso l'alto per entrare nella pelle per via sottocutanea a 5 - 10 mm dal capezzolo; Quindi, segui il "tunnel" fino a quando la punta dell'ago non si avvicina al capezzolo, sposta con cautela la punta dell'ago verso l'alto nel cuscinetto adiposo mammario fino a quando la cruna dell'ago non arriva sotto la punta del capezzolo, scarta le pinzette e inietta le cellule lentamente.
- Girare leggermente l'ago e ritrarre lentamente la siringa; utilizzare un batuffolo di cotone per premere la ferita dell'ago per 10 - 20 secondi per assicurarsi che non vi siano infiltrazioni di liquido.
- Osservare il quarto capezzolo per confermare l'avvenuta iniezione: si può osservare una sfera piatta bianca trasparente con il capezzolo al centro (Figura 1).
- Tieni i topi anestetizzati per un altro minuto per evitare che i topi si riprendano e si muovano troppo velocemente, il che causerà l'apertura della ferita da iniezione e la fuoriuscita delle cellule tumorali.
Figura 1: Immagini prima e dopo l'iniezione ortotopica sul cuscinetto adiposo mammario di topi femmina Balb/c. L'operazione è stata eseguita e le foto sono state scattate mentre i topi erano in anestesia con isoflurano. A, prima dell'iniezione, B, dopo l'iniezione.