Articolo metodologico

Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

DOI:

10.3791/2006

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3 novembre 2010

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1Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

In questo articolo

Sommario

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Navette molecolari costituiti da microtubuli funzionalizzati scivolando sulla superficie aderito chinesina proteine ​​motore può servire come sistema di trasporto su scala nanometrica. Qui, l'assemblaggio di un sistema di navetta tipico è descritto.

Abstract

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Le cellule hanno sviluppato sofisticate macchine molecolari, come chinesina proteine ​​motrici e filamenti di microtubuli, al sostegno attivo di trasporto intracellulare di carico. Mentre kinesins coda dominio si lega ad una varietà di carichi, domini testa kinesins utilizzare l'energia chimica immagazzinata nelle molecole di ATP per passo lungo il reticolo microtubuli. Il lungo e rigido microtubuli fungono da piste per lunghe distanze di trasporto intracellulare.

Questi motori e filamenti possono anche essere impiegati in microfabbricazione ambienti sintetici come componenti di navette molecolari 1. In un progetto di uso frequente, i motori chinesina sono ancorati alla superficie della pista con la coda, e microtubuli funzionalizzate servire come elementi costitutivi di trasporto merci, che sono spinti da questi motori. Queste navette possono essere caricati con il carico utilizzando il legame forte e selettiva tra biotina e streptavidina. I componenti chiave (tubulina biotinilato, streptavidina, e carico biotinilato) sono disponibili in commercio.

Sulla base del classico saggio motilità invertita 2, la costruzione di navette molecolari è dettagliata qui. Chinesina proteine ​​motrici sono assorbiti da una superficie coperte con caseina; microtubuli sono polimerizzati da tubulina biotinilato, ha aderito al chinesina e successivamente rivestito con streptavidina marcata con rodamina. La concentrazione di ATP è mantenuto a concentrazione subsaturating di raggiungere una velocità ottimale microtubulo scorrimento per il carico merci 3. Infine, biotinilato marcato con fluoresceina nanosfere vengono aggiunti come merce. Nanosfere allegare ai microtubuli a causa di collisioni tra microtubuli volo a vela e nanosfere aderire alla superficie.

Il protocollo può essere facilmente modificato per caricare una varietà di carichi come il DNA biotinilato 4, 5 o quantum dots una vasta gamma di antigeni tramite anticorpi biotinilati 4-6.

Protocollo

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1.) Tamponi e reagenti

Queste soluzioni dovrebbero essere preparate in anticipo e conservato in aliquote comodamente dimensioni. Una aliquota dovrebbe contenere soluzione sufficiente per un tipico esperimento e una nuova aliquota dovrebbe essere utilizzato per ogni dosaggio motilità. Le condizioni di conservazione e le dimensioni aliquota tipici sono menzionati anche i seguenti protocolli.

1. BRB80 tampone, (80 TUBI mM, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionizzata distillata (gg) l'acqua, pH regolato a 6,9 con KOH)

  • Portare a 100 mL di soluzione madre di 0,5 M EGTA in acqua gg. Regolare il pH a 7,0 ....

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Discussione

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Con piccole modifiche, questo protocollo è stato usato con successo da una varietà di gruppi di assemblare chinesina-microtubuli saggi motilità base. DTT 10 mM nella soluzione motilità finale può essere sostituito con lo 0,5% β-mercaptoetanolo. Soluzioni standard (BRB80AF, KIN20 e MT1000) più di 2 ore di vita non deve utilizzare. Qualsiasi soluzione contenente microtubuli taxolo e soprattutto non devono mai essere posti su ghiaccio. L'eccessiva esposizione della cella di flusso ai risultati UV luce di eccitazione ne.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Siamo fortemente indebitati a Jonathon Howard, il cui gruppo ha sviluppato il protocollo di base per un test di volo a vela motilità che è stato successivamente adattato da noi. Il sostegno finanziario NSF concedere DMR0645023 Si ringrazia.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adenosina-5’-trifosfato (ATP)InvitrogenA1049
Tubulina biotinilataCytoskeleton, Inc.T333
CaseinaSigma-AldrichC-0376
CatalasiSigma-AldrichC-9322
Glucosio D-(+)Sigma-AldrichG-7528
Dimetilsulfossido (DMSO)Sigma-AldrichD-8779
Ditiotreitolo (DTT)Bio-Rad161-0610
Acido etilenglicole-bis(2-ammino–etiletiletere)-N,N,N′,N′-tetraacetico (EGTA)Sigma-AldrichE-4378
Microsfere biotinilate FluoSpheres, 40 nm, fluorescenti giallo-verdi (505/515)InvitrogenF-8766
Glucosio ossidasiSigma-AldrichG-7016
Guanosina-5’-trifosfato (GTP)Roche Group106399
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich63069
Paclitaxel (Taxolo)Sigma-AldrichT1912
Acido 1,4-piperazindietanosulfonico, piperazina-1,4-bis(2-etanosulfonico), piperazina-N,N′-bis(2-etanosulfonico) (PIPES)Sigma-AldrichP-6757
Iodrato di potassio (KOH)Sigma-AldrichP-6310
Iodrato di sodio (NaOH)Sigma-Aldrich480878
Streptavidina coniugata con Alexa Fluor 568InvitrogenS11226

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
  2. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.<....

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Motori di chinesinatrasporto microtubularelegame biotina streptavidinamicroscopia a fluorescenzasaggio di motilit inversoconcentrazione di ATPrivestimento con caseinacaricamento di nanosferevelocit di scorrimento

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