Questo protocollo è un estratto da Zhao et al, Elettrocardiografia di superficie in vivo per pesci zebra adulti, J. Vis.(2019).
Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti in conformità con la Guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutti i protocolli sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'UCLA.
1. Induzione dell'anestesia
- Preparare l'anestesia ad immersione per il controllo del dolore e l'immobilizzazione dei pesci per evitare artefatti da movimento durante l'acquisizione dei dati ECG. La maggior parte dei laboratori utilizza la tricaina per immersione (etil-3-amminobenzoato metanosolfonato, MS-222).
- Per preparare la soluzione madre di tricaina allo 0,4%, combinare i seguenti elementi in un flacone di vetro scuro con tappo a vite: 400 mg di polvere di tricaina, 98 ml di acqua distillata doppia e 2 ml di Tris 1 M (pH 9). Regolare a pH 7,0 utilizzando 1 N NaOH o 1 N HCl secondo necessità.
- Per preparare la soluzione finale di immersione della tricaina, determinare la concentrazione minima appropriata per l'età, le dimensioni, lo stato metabolico, il ceppo, il modello di malattia, gli obiettivi scientifici e la durata della procedura del pesce zebra.
- Eseguire uno studio concentrazione-risposta della tricaina, titolando verso l'alto o verso il basso la concentrazione raccomandata di 168 mg/L (o 0,0168%)9se necessario, per raggiungere il livello 4 di anestesia entro 3 minuti con il minor numero possibile di tossicità cardiorespiratorie. Ad esempio, in questo studio, l'immersione di zebrafish AB wild-type di età compresa tra 12 e 18 mesi in una soluzione di tricaina allo 0,02-0,04% indurrà il livello 4 di anestesia entro 3 minuti
NOTA: Al livello 4 di anestesia, l'equilibrio e il tono muscolare sono completamente persi e la velocità di movimento opercolare è ridotta.
- Se necessario, consultare il veterinario del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per ulteriori indicazioni sull'adeguatezza della selezione dell'anestetico e della via di somministrazione.
- Immergere un pesce zebra adulto in una capsula contenente una soluzione di tricaina della concentrazione più bassa, predeterminata e approvata da IACUC (ad esempio, 0,02-0,04% in questo studio) per indurre il livello 4 di anestesia entro 3 minuti (Figura 1).
- Per il protocollo ECG di sopravvivenza, mantenere la sessione di registrazione ECG il più breve possibile (meno di 10 minuti). Per brevi sessioni di registrazione ECG di durata inferiore a 15 minuti, non è necessario il mantenimento dell'anestesia.
- Per lunghe sessioni di registrazione ECG della durata di ore, utilizzare un sistema di perfusione intramuscolare a lunga durata d'azione e un sistema di perfusione orale per fornire un'ampia idratazione e ossigenazione.
2. Posizionamento della derivazione ECG
- Una volta che il pesce zebra mantiene il livello 4 di anestesia per 3 secondi, utilizzare un paio di pinze smussate per trasferire immediatamente il pesce sulla fessura di spugna umida con la superficie ventrale rivolta verso l'alto per il posizionamento degli elettrodi di derivazione ECG (Figura 2).
- Inserire delicatamente i tre elettrodi dell'elettrocatetere ECG nella muscolatura del pesce a una profondità di circa 1 mm per stabilire un elettrocatetere bipolare sul piano frontale parallelo all'orientamento caudale sinistro-cranico destro dell'asse principale cardiaco.
- Posizionare l'elettrodo positivo (rosso) nella linea mediana ventrale a livello del bulbo arterioso, cioè a 1-2 mm sopra una linea immaginaria che collega i due bordi inferiori degli opercoli (Figura 2A).
- Posizionare l'elettrodo negativo (nero) caudalmente e 0,5-1,0 mm a sinistra rispetto all'elettrodo positivo, a una distanza maggiore della lunghezza apicobasale massima del ventricolo adulto di zebrafish (Figura 2A).
- Posizionare l'elettrodo di riferimento (verde) caudalmente, vicino alla regione anale.
NOTA: Poiché l'asse principale cardiaco varia leggermente da pesce a pesce, per massimizzare le ampiezze delle onde R e T, regolare le posizioni dell'elettrocatetere apportando solo piccole modifiche sistematiche attraverso tentativi ed errori. Ad esempio, è possibile sostituire un elettrodo (positivo o negativo), anziché entrambi gli elettrodi, alla volta e apportare modifiche graduali in una direzione specificata prima di passare a un'altra direzione, invece di apportare modifiche irregolari in direzioni casuali.
3. Registrazione ECG
- Aprire il programma di acquisizione dati ECG. Selezionare l'impostazione desiderata dai menu a discesa per portata, passaggio basso e passaggio alto. Ad esempio, la seguente impostazione nel sistema di registrazione ECG in vivo utilizzato in questo esperimento produce un rapporto segnale/rumore coerente e soddisfacente per un normale pesce zebra adulto: intervallo "2 mV", passa basso "120 Hz" e passa alto "0,03 s".
- Premere Start per avviare la registrazione ECG continua senza interruzioni a una frequenza di campionamento di 1 kHz.
- Per ottimizzare il posizionamento dell'elettrocatetere per il massimo rapporto segnale/rumore, premere Stop per interrompere la registrazione ECG e rivedere il tracciato ECG subito dopo il primo tentativo di registrazione per ciascun cuore. Per diagnosticare che un ECG di zebrafish adulto è normale, verificare che tutti i seguenti quattro criteri di convalida siano soddisfatti (Figura 3):
- Criterio 1: Assicurarsi che tutte le forme d'onda ECG (P, QRS e T) siano distinte e facilmente visibili.
- Criterio 2: Assicurarsi che l'onda P sia positiva.
- Criterio 3: Assicurarsi che il complesso QRS netto sia positivo (cioè che l'ampiezza dell'onda R sia maggiore della somma delle ampiezze delle onde Q e S).
- Criterio 4: Assicurarsi che l'onda T sia positiva.
- Se si prevede un ECG normale, riposizionare gli elettrodi (provare prima l'elettrodo negativo) se necessario, fino a quando tutti e quattro i criteri di convalida non sono soddisfatti.
- Se ci si aspetta un'onda T normale, ma l'onda T è troppo piccola, riposizionare gli elettrodi per massimizzare l'ampiezza dell'onda T.
- Riprendi la registrazione dell'ECG dopo aver ottimizzato il posizionamento dell'elettrocatetere. Salvare le scansioni ECG per l'analisi successiva.
4. Recupero dall'anestesia
- Al termine della sessione di registrazione ECG, rimuovere con cura gli elettrodi senza ferire il pesce. Trasferire il pesce in acqua fresca, ossigenata e priva di tricaina.
- Per facilitare il recupero dall'anestesia, spruzzare energicamente l'acqua sulle branchie con una pipetta Pasteur fino a quando il pesce non riprende il movimento regolare delle branchie o a nuotare.
- Monitorare il pesce per il completo recupero dall'anestesia (in genere 1-2 minuti), come indicato dalla capacità del pesce di nuotare in posizione eretta per almeno 5 s.
