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1. Calibrazione dei parametri di tracciamento video
- Prima di adottare misure comportamentali, impostare i parametri di osservazione e calibrazione nel software della traccia video (vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare una piastra a pozzetti nella camera di registrazione con almeno 1 pesce larvale in un singolo pozzetto. Utilizzare la piastra e il pesce associato come rappresentazioni per impostare i parametri di calibrazione.
- Nel software della traccia video, fai clic su "File | Genera protocollo", che aprirà una finestra di dialogo "procedura guidata per la creazione del protocollo". Nel campo "Conteggio posizione", inserire il numero di pozzetti individuali della piastra a pozzetti e quindi fare clic su "OK".
- Nella parte superiore dello schermo, fai clic su "Visualizza | Schermo intero", che richiederà al sistema di visualizzare una vista della telecamera dall'alto della piastra del pozzetto.
- Fai clic sull'icona "Disegna aree", che appare come tre forme multicolori. A destra dell'area di visualizzazione della piastra a pozzetti, selezionare l'icona del cerchio nel campo "Aree".
- Utilizzare il cursore per delineare l'area di tracciamento video circolare nel pozzetto in alto a sinistra della piastra del pozzetto. Seleziona "Segno in alto a destra" e quindi delinea l'area di visualizzazione del pozzetto in alto a destra. Quindi, seleziona "Bottom Mark" per delineare il pozzetto in basso a destra.
NOTA: Dopo aver disegnato il contorno circolare, probabilmente sarà necessario regolarne la posizione. Per regolare la posizione del contorno, fare clic su "seleziona" e quindi utilizzare il cursore per spostare l'area delineata. Inoltre, i contorni possono essere replicati facendo clic su "Copia" e poi su "Incolla".
- Dopo aver definito le aree di tracciamento dei pozzi in alto a sinistra, in alto a destra e in basso a destra, fare clic su "Costruisci" per richiedere al software di delineare automaticamente le aree di visualizzazione dei pozzetti rimanenti.
- Nell'area denominata "Calibrazione", fare clic su "Disegna scala". Utilizzare il cursore per disegnare una linea orizzontale attraverso la piastra. Una volta tracciata la linea, verrà visualizzata una finestra di dialogo con l'etichetta "Misurazione della calibrazione". Immettere la lunghezza della piastra del pozzetto e fare clic su "OK".
- Uscire dal gestore disegni facendo clic sull'icona "Disegna aree".
- Fare clic sull'icona "Tessere". Utilizzando il cursore, evidenziare tutte le caselle che appaiono sullo schermo di visualizzazione in modo che ogni casella sia verde.
NOTA: L'icona Piastrelle appare come un gruppo di sei quadratini individuali
- "Fare clic su Visualizza| Schermo intero". A destra dell'area di visualizzazione della targa, fare clic su "Bkg" nella casella denominata "Soglia di rilevamento". Utilizzare la barra di regolazione della soglia per impostare la soglia di rilevamento dei pixel. Una volta selezionata la soglia di rilevamento dei pixel appropriata, fare clic su "Applica al gruppo".
NOTA: Questo protocollo imposta la soglia di rilevamento a 13 in modalità nera per le osservazioni di zebrafish e a 110 in modalità trasparente per le osservazioni di pesciolini grassi.
- Nella casella denominata "Soglia di movimento", inserisci i parametri di tracciamento della velocità di movimento desiderati. Una volta impostati i parametri di velocità, fare clic su "Applica al gruppo".
NOTA: Questo protocollo imposta i movimenti piccoli/grandi a 20 mm/s e i movimenti inattivi/piccoli a 5 mm/s. Queste selezioni programmano il software per tracciare il movimento delle larve dei pesci a tre diversi livelli di velocità: inattivo (congelamento) = <5 mm/s, piccolo (crociera) = 5-20 mm/s e grande (scoppio) = >20 mm/s.
- Fare clic su "Parametri | Parametri protocollo" dal menu a discesa. Nella finestra di dialogo, seleziona la scheda "Ora". Inserire il tempo di osservazione e il tempo di integrazione. Dopo aver inserito i parametri, fare clic su "Ok".
- Per impostare i tempi del fotoperiodo luce/buio e l'intensità della luce per ciascun fotoperiodo, aprire la finestra di dialogo delle impostazioni del driver della luce selezionando "Light Driving" dal menu a discesa "Parametri".
NOTA: Vedere il protocollo video per l'impostazione di più fotoperiodi chiaro-scuro.
- Dopo aver impostato i parametri di tracciamento video, salvare il protocollo di osservazione.
NOTA: Questo protocollo osserva il comportamento dei pesci per un periodo di 50 minuti che include una fase di acclimatazione di 10 minuti seguita da 4 fasi di alterazione luce/buio costituite da due periodi di luce di 10 minuti e due periodi di buio di 10 minuti. Il tempo di integrazione è impostato per misurare il comportamento per ogni minuto della prova comportamentale di 50 minuti.
2. Osservazione del comportamento locomotore e fotomotorio dei pesci larvali
- Posizionare la piastra a pozzetti contenente i pesci sperimentali nella camera di registrazione comportamentale.
- Nel software di tracciamento video, aprire il protocollo di tracciamento sviluppato nel passaggio successivo.
- Nel visualizzatore di tracciamento video, verificare che tutte le larve siano visibili sullo schermo del computer, che sia presente una sola larva in ciascun pozzetto e che i singoli pozzetti siano allineati all'interno delle aree di osservazione definite nei passaggi 1.1.5 e 1.1.6.
- Clicca su "Esperimento | Esegui".
NOTA: Il sistema chiederà all'utente di fornire un nome e una posizione per salvare i dati di osservazione.
- Una volta specificato il nome e la posizione di salvataggio dei dati di osservazione, fare clic sull'icona "Diverse immagini dal vivo" per evidenziare tutte le aree di visualizzazione predefinite
NOTA: Questa icona si trova nella parte superiore dello schermo del computer e appare come una casella divisa in quattro quadrati più piccoli. Facendo clic su questa icona verranno evidenziate tutte le aree di visualizzazione predefinite.
- Chiudere il pannello della camera di registrazione e fare clic su "Sfondo | Start" sul monitor del computer.