Saggio di cattura della preda: un metodo per studiare il comportamento di cattura della preda della larva di pesce zebra

Abstract

Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e la sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp.(2018)

Questo video descrive il test di cattura della preda. Il video discute il metodo per studiare il comportamento di cattura delle prede delle larve di zebrafish dopo l'ablazione laser di specifici neuroni.

Protocollo

1. Valutazione delle conseguenze comportamentali dopo l'ablazione laser

1. Imposta un sistema di registrazione comportamentale che consiste in uno stereoscopio dotato di videocamera. Utilizzare una fotocamera con un software di acquisizione immagini appropriato, commerciale o personalizzato (Figura 1A).
2. Ottimizza le condizioni di illuminazione in modo che il paramecio possa essere rilevato dall'elaborazione delle immagini. Ad esempio, utilizzare una luce LED bianca ad anello con un distanziatore (Figura 1B).
   Nota: la distanza e l'angolo del LED influiscono sull'aspetto del campione (ad esempio, luminoso su sfondo scuro o scuro su sfondo chiaro) e sono, quindi, fondamentali per il successo dell'elaborazione delle immagini. Determinare l'altezza migliore del distanziatore (Figura 1C).
3. Posizionare una larva di pesce zebra (recuperata dall'esperimento di ablazione laser descritto nella Sezione 1) in una camera di registrazione comportamentale (che è stata attaccata a un vetrino) con il sigillo superiore originale rimosso (Figura 1D).
4. Raccogliere 50 paramecia sospesi in acqua dal becher utilizzando una micropipetta e posizionarli nella camera di registrazione.
5. Posizionare un vetrino coprioggetto sopra la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia d'acqua sul vetrino coprioggetti prima di posizionarlo sulla superficie dell'acqua della camera di registrazione per evitare di introdurre aria nella camera.
   Nota: In questa fase, un po' d'acqua con paramecia traboccherà dalla camera di registrazione. Il numero rimanente di paramecia nella camera di registrazione sarà di circa 30-40.
6. Posizionare la camera di registrazione (contenente una larva e un paramecia) nel sistema di illuminazione (Figura 1D).
7. Avviare la registrazione time-lapse a 10 fps per 11 minuti (6.600 fotogrammi).
8. (Facoltativo) Per ogni larva che è stata testata per il comportamento, osservare la fluorescenza delle aree ablate con laser mediante microscopia fluorescente per confermare l'efficacia dell'ablazione laser (cioè l'assenza o un numero significativamente ridotto di cellule fluorescenti nell'area irradiata con il laser).
   Nota: Anche dopo l'irradiazione, alcune cellule fluorescenti possono ancora essere osservate a causa dell'insorgenza tardiva dell'espressione genica Gal4 nelle cellule che si sono differenziate dopo l'ablazione.
9. Dopo aver registrato il comportamento della larva, per compensare la mancanza di uniformità sullo sfondo, eseguire una divisione pixel per pixel di ogni fotogramma per un'immagine media nelle Figi: fare clic su "Elabora", "Calcolatore di immagini", "Operazione: Dividi", "Risultato a 32 bit (float)" e "OK". Per creare un'immagine media, fare clic su "Immagine", "Pile", "Progetto Z", "Intensità media" e "OK" (Figura 1E, F).
10. Conta il numero di paramecia rimasti nella camera facendo clic su 'Analizza', 'Analizza particelle', impostando un intervallo di area che copre tutti i paramecia, selezionando la casella di controllo 'Mostra:Maschere' e facendo clic su 'OK'. L'opzione 'Mostra:Maschere' fornirà un'immagine di paramecia estratta (Figura 1G), con un elenco del numero di particelle (paramecia) in ogni fotogramma.
11. Traccia il numero di parameci rimasti nella camera di registrazione nel tempo. Poiché le stime del numero di parameci sono rumorose, si consiglia di eseguire una media mobile su ogni punto in un intervallo di 600 fotogrammi (1 min) sul foglio di calcolo.

Risultati

Figura 1. Saggio di cattura delle prede e dati rappresentativi nelle larve di zebrafish ablate al laser.(A) Sistema di registrazione comportamentale. Lo stereomicroscopio era dotato di una fotocamera CMOS. Le immagini sono state acquisite utilizzando uno script personalizzato. (B) Componenti del sistema di illuminazione. Una carta di colore grigio, un diffusore in vetro, una luce anulare...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camere di imaging	Grace Bio-Labs	Camere di imaging CoverWell PCIA-2.5	Utilizzato come camera di registrazione comportamentale
ORCA-Flash4.0	Fotonica di Hamamatsu	Modello: C11440-22CU	Una fotocamera CMOS scientifica
SZX7	Olimpo		stereoscopio
Una luce LED ad anello	Ccs	Modello: LDR2-100SW2-LA	LED bianco
Guarnizione per camera di ibridazione Secure-Seal, 8 camere, diametro 9 mm x profondità 0,8 mm	Sonde molecolari	Catalogo # S-24732	Utilizzata come camera di registrazione nell'imaging Ca