Escape Response Assay: un metodo per studiare la risposta della larva di zebrafish agli stimoli tattili

Abstract

Fonte: Sztal, T. E., et al. Utilizzo di saggi di risposta e locomozione evocati dal tocco per valutare le prestazioni e la funzione muscolare nel pesce zebra. J. Vis. Exp.(2016)

Questo video descrive il test di risposta all'evocazione tattile, che misura la risposta della larva di pesce zebra agli stimoli tattili.

Protocollo

1. Saggio di risposta evocato al tocco

1. Preparazione di 2 embrioni dpf per il test di risposta evocata al tatto
   1. Assicurarsi che l'ora del giorno in cui viene condotto il test sia coerente tra gli esperimenti, poiché l'attività può variare notevolmente durante il giorno.
      NOTA: L'esperimento deve essere eseguito in cieco e l'ordine dei test randomizzato per ridurre al minimo gli artefatti sperimentali.
   2. Assegna ai ceppi di pesce un numero, che è sconosciuto all'individuo che esegue l'esperimento. Successivamente, l'utilizzo di strumenti online disponibili gratuitamente genera un elenco casuale che determina l'ordine dei test.
   3. Almeno un'ora prima del test, dechorionate gli embrioni facendo un foro nel corion e separandolo delicatamente usando un paio di pinzette sottili. Rimuovere eventuali detriti dalla capsula di Petri prima di rimetterla nell'incubatore a 28 °C.
2. Esecuzione del saggio di risposta evocata dal tocco
   1. Riscaldare la fase a 28 °C almeno 15 minuti prima dell'inizio del test.
      NOTA: Questa fase è a temperatura controllata e rimarrà a 28 °C per tutta la durata del test. La temperatura influenzerà l'attività ed è quindi importante mantenere una temperatura costante. Se non è disponibile uno stadio riscaldato, la temperatura dell'acqua deve essere monitorata e tutti gli esperimenti devono essere condotti alla stessa temperatura.
   2. Posizionare una capsula di Petri riempita con terreno embrionale (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ in acqua) su un tavolino illuminato e montare la telecamera ad alta velocità sopra la capsula di Petri.
   3. Avvia il software di registrazione della videocamera (come Stream Pix 5, descritto qui) e nella scheda "area di lavoro" seleziona 1.000 fotogrammi al secondo (1.000 fps) come velocità di acquisizione per assicurarti che venga registrata l'azione di nuoto veloce del pesce.
   4. Lavorando con un embrione alla volta, posiziona l'embrione al centro della capsula di Petri con il pesce zebra chiaramente visibile nel campo visivo.
      NOTA: Se l'embrione nuota via prima dell'inizio dell'esperimento, sostituirlo con un altro, poiché la ricattura e il posizionamento dell'embrione possono comportare la desensibilizzazione allo stimolo e le risposte ripetute possono promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia.
   5. Inizia la registrazione facendo clic sul pulsante "registra" e invia lo stimolo meccanosensoriale all'embrione toccandolo delicatamente con un ago smussato sulla parte superiore della testa.
   6. Interrompere la registrazione dopo che l'embrione è uscito dal campo visivo o è tornato a riposo.
      NOTA: L'accelerazione raggiunge il picco entro i primi 0,2 secondi della risposta di fuga dal burst dopo lo stimolo meccanico. Pertanto, assicurarsi che almeno durante i primi 0,2 secondi della registrazione della risposta di fuga il pesce si trovi nel campo visivo. Utilizzando il software Stream Pix 5, i dati verranno automaticamente salvati come file video .avi. È possibile utilizzare anche software di acquisizione video alternativi come Free Video Capture o Softonic, entrambi disponibili gratuitamente per il download.
   7. Trasferisci l'embrione in una nuova capsula di Petri e seleziona un altro embrione per il test. Eseguire il test su un minimo di 15 pesci.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre Petri da 90 mm	Prodotti da laboratorio del Pacifico	PT S90001
Pinzette, stile 8	ProSciTech	T04-821
incubatrice	Thermoline Scientifica	TEI-43L
Telecamera ad alta velocità	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Passaggio 1.2.3
Unità di controllo della temperatura	punto di vista
http://www.randomization.com	N/A		Passaggi 1.1.2