Screening della tossicità chimica basata sugli embrioni: valutazione degli effetti sullo sviluppo di embrioni di zebrafish

Abstract

Fonte: Hao J. et al., Schermo in vivo per piccole molecole basato su pesce zebra su larga scala. J. Vis. Exp. (2010)

In questo articolo, gli embrioni di zebrafish vengono utilizzati per lo screening della tossicità chimica. La tossicità chimica è correlata alle letture del fenotipo. Il protocollo del campione mostra un approccio metodologico per l'esecuzione dello screening della tossicità chimica.

Protocollo

1. Trasferimento della libreria di piccole molecole

Sebbene il trasferimento di composti possa essere automatizzato con metodi di trasferimento robotico, descriveremo il metodo di trasferimento manuale.

1. Le librerie di piccole molecole sono generalmente fornite in un formato a 96 pozzetti, con ogni composto memorizzato in DMSO come stock da 10 mM. Circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano la fase in cui devono essere aggiunti i composti, scongelare un numero desiderato di piastre da 96 pozzetti contenenti aliquote di piccole molecole (piastra sorgente). Prendere nota del numero di serie o di altro numero di identificazione delle targhette di origine. Per ridurre al minimo la condensa sulle piastre, lo scongelamento può avvenire in una camera di essiccazione contenente Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. Far girare brevemente le piastre in una centrifuga da tavolo dotata di adattatore per piastre a più pozzetti.
3. Rimuovere il nastro sigillante in alluminio dalla piastra di origine. Utilizzando una pipetta a 12 canali, diluire i composti nella piastra di origine alla concentrazione di 0,5 mM (ad esempio, se si inizia con aliquote da 250 nL di 10 mM, aggiungere 4,75 μL di DMSO a ciascun pozzetto).
4. Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti (piastra ricevente) raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali (2-20 μL) per trasferire 2,5 μL di composti (0,5 mM) dalle piastre di origine alle piastre riceventi contenenti gli embrioni.
5. Registrare il numero di identificazione delle piastre di origine sulle piastre per embrioni riceventi. Coprire le piastre riceventi che ora contengono gli embrioni e i composti con i coperchi, mescolare delicatamente le piastre agitandole delicatamente e metterle in un'incubatrice a 28,5°C.
6. Coprire ogni piastra di origine contenente piccole molecole inutilizzate (0,5 mM) con un nastro sigillante di alluminio e metterla in un congelatore a -80°C per una conservazione a lungo termine.

2. Screening degli effetti di piccole molecole mediante ispezione visiva dei fenotipi

1. Prima di eseguire lo screening, formulare un criterio specifico per ciò che costituirebbe un "colpo".
2. Nei momenti desiderati dello sviluppo, rimuovere dall'incubatrice le piastre da 96 pozzetti contenenti embrioni trattati con composti ed esaminare ogni pozzetto allo stereomicroscopio. Per una migliore visualizzazione di cambiamenti sottili, come i cambiamenti nel modello circolatorio, è possibile utilizzare un microscopio invertito a contrasto di fase. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per esaminare la perturbazione dell'espressione delle proteine GFP o DsRed sotto un promotore tessuto-specifico.
3. Scansiona rapidamente le piastre da 96 pozzetti per individuare eventuali pozzetti in cui almeno 3 embrioni su 5 mostrano il fenotipo "hit" prescritto. Registra l'identità della piastra e la posizione del pozzo di ogni potenziale colpo.
4. Riconfermare un potenziale successo testando nuovamente gli effetti del composto a diverse dosi (1 uM, 5 uM, 10 μM e 50 μM). Per ogni dose, 10 embrioni vengono testati in 0,5 mL di terreno E3 in un formato di piastra a 48 pozzetti. La tempistica dell'aggiunta del composto per la ripetizione del test deve essere identica a quella dello screening originale. Un hit è confermato quando il fenotipo suscitato viene riprodotto al ritest del composto
5. Identificare il composto colpito dal database di piccole molecole nella libreria chimica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Libreria di piccole molecole di composti strutturalmente diversi disposti in un formato 96-wll a 10 mM stock in DMSO. Ogni piastra master viene aliquotata in piastre di stoccaggio in polipropilene a 96 pozzetti (Corning) e conservata a -80°C fino a usare.
Drierite	W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH
Pipette a 12 canali, 2-20 μL	Eppendorf
Nastro sigillante in alluminio per piastre a 96 pozzetti	Nunc, Rochester, NY
Dmso	Sigma, St. Louis, MO
Incubatore di base, 28,5°C	Fisher Scientifico
Piastre per saggi a fondo tondo a 96 pozzetti in polistirene	Corning COSTAR; Lowell, MA
Stereomicroscopio con base a luce trasmessa	Leica Microsystems, Bannockburn, IL
Terreno embrionale E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 , contenente lo 0,003% di PTU (feniltiocarbamide, Sigma; St. Louis, MO).			La PTU può essere preparata come soluzione 10x sciogliendo 0,3 g di PTU in 1 L di terreno embrionale E3. Le soluzioni contenenti PTU devono essere protette dalla luce coprendole con un foglio di alluminio.