1. Preparazione di embrioni/larve
- Trasferire 100 embrioni in una capsula di Petri da 100 mm con 25 ml di acqua d'uovo. Conservare non più di 100 embrioni per capsula di Petri e allevarli a 28 °C.
- Per inibire la pigmentazione, aggiungere feniltiourea (PTU) nelle piastre di Petri prima di 10 ore dopo la fecondazione (hpf) e allevare embrioni/larve fino a 80 hpf. La concentrazione finale di PTU è di 0,2 mM.
ATTENZIONE: Il PTU è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida per l'uso appropriate.
- Anestetizzare le larve aggiungendo estere etilico dell'acido 3-amminobenzoico (Tricaina), a una concentrazione finale dello 0,016%, nelle piastre di Petri. Quindi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza, selezionare le larve CFP-positive. Usa larve con un fegato di dimensioni simili e scarta quelle con un fegato più piccolo o più grande.
NOTA: qualsiasi larva CFP-positiva, indipendentemente dall'intensità, può essere utilizzata perché non vi è alcuna differenza nell'entità dell'ablazione degli epatociti tra le lar>ATTENZIONE: la tricaina è tossica. Utilizzare in conformità con le linee guida per l'uso appropriate.
- Rimuovere l'acqua d'uovo contenente tricaina e aggiungere acqua d'uovo integrata con 0,2 mM PTU. Mantenere gli embrioni/larve a 28 °C.
2. Trattamento Mtz
- Preparare una soluzione fresca di Mtz da 10 mM sciogliendo 0,171 g di polvere di Mtz in 100 ml di acqua d'uovo integrata con DMSO allo 0,2% e PTU 0,2 mM. Per sciogliere completamente l'Mtz, mescolare la soluzione a RT con agitazione rapida per 20-30 minuti. Per aiutare a solubilizzare Mtz e migliorare la permeazione di Mtz nelle larve, aggiungere DMSO durante la preparazione di Mtz.
ATTENZIONE: l'esposizione prolungata o l'aumento della concentrazione di Mtz è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida per l'uso appropriate.
- Separare le larve in gruppi di controllo e sperimentali trasferendo il numero desiderato di larve in due diverse piastre di Petri da 100 mm o in una piastra a più pozzetti. Per il gruppo sperimentale, mantenere le larve in soluzione di 10 mM Mtz; per il gruppo di controllo, tenerli in acqua d'uovo contenente lo 0,2% di DMSO.
- Coprire le piastre o le piastre di Petri contenenti la soluzione di Mtz con un foglio di alluminio per evitare la fotoinattivazione di Mtz e incubare a 28 °C. La durata del trattamento con Mtz dipende dallo stadio larvale e dalla linea transgenica.
3. Analisi della rigenerazione epatica indotta dalle vie biliari
- Al termine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione di Mtz dalle piastre. Lavare le larve trattate con Mtz aggiungendo 25 ml di acqua d'uovo. Agitare il piatto 2-3 volte per lavare le larve prima di scartare l'acqua dell'uovo. Ripeti tre volte e poi immergi nuovamente le larve nell'acqua d'uovo. Per evitare l'edema cardiaco e la morte larvale nelle larve trattate con Mtz, aggiungere una concentrazione più bassa di Tricaina, a una concentrazione finale dello 0,008%, per immobilizzare le larve.
- Per l'analisi del fegato, esaminare le dimensioni del fegato delle larve trattate con Mtz al microscopio a epifluorescenza con il filtro CFP. Valutare i livelli di ablazione degli epatociti in base alle dimensioni relative del fegato: grande (non ablato; 0-10% larve), medio (parzialmente ablato; 10-20%) e molto piccolo (completamente ablato; 80-90%).
