Iniezione di Morpholino: un metodo per abbattere l'espressione genica bersaglio per studiare la funzione nel pesce zebra

In questo articolo

Abstract

Fonte: Hyde D.R., et al. Elettroporazione in vivo di Morpholinos nella pinna caudale del pesce zebra adulto rigenerante. J. Vis. Exp. (2012)

Il protocollo descrive l'abbattimento mirato dell'espressione genica nel pesce zebra mediante iniezione di morfolino nella coda.

Protocollo

1. Iniezione di Morpholino

Il giorno prima dell'iniezione del morpolino, fare una piastra per iniezione (Figura 1). Assicurati di ritagliare una tacca a un'estremità del pozzo, che aiuta a stabilizzare il pesce per la procedura di microiniezione.
Diluire il morpolino marcato con fluoresceina alla giusta concentrazione (si consiglia di iniziare con 1,2 mM) e porre a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti.
Caricare l'ago con il morfolino (nota: a seconda che si riempia o si carichi frontalmente, l'ago determinerà se si carica prima l'ago o se si taglia prima la punta).
Tagliare la punta dell'ago ad angolo.
Seguire le istruzioni del sistema di microiniezione per iniettare una bolla di morfolino di circa 5 nl per iniezione. Volumi maggiori di morfolino potrebbero distruggere il tessuto.
Anestetizzare il pesce e metterlo sulla piastra di iniezione. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e orientare l'ago nella posizione appropriata, appena distale al raggio osseo (Figura 2). Utilizzando un microscopio e un apparecchio per microiniezione appropriato per iniezioni di morfolino (vedere la tabella dei reagenti specifici), iniettare il morfinolino nella pinna da anteriore a posteriore, come mostrato nella Figura 2. L'iniezione da parte posteriore a quella anteriore provoca l'arrotolamento del tessuto della pinna durante l'iniezione ed è molto difficile.
Inserire delicatamente l'ago nel tessuto rigenerativo, appena distalmente a ciascun raggio osseo (contrassegnato con "1" nella Figura 2) e spingere distalmente fino a quando non si trova nel blastema (contrassegnato con "2" nella Figura 2). Fare attenzione a non spingere l'ago attraverso l'intera pinna. Quando l'ago è localizzato correttamente, iniettare il morfolino (cioè fare clic una volta). A 1,2 mM, la soluzione di morfolino marcata con fluoresceina appare giallo-verde, anche in condizioni di luce normali. Ad ogni iniezione, è possibile visualizzare un "soffio" giallo di soluzione di morfolino, che aiuta a localizzare l'iniezione nel blastema. Circa 75 nl (10-15 clic) di soluzione di morfolino devono essere iniettati per raggio osseo. Pausa ~ 1 secondo tra i clic. Iniettiamo solo il lato dorsale, usando il ventrale come controllo solo per l'elettroporazione.

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Risultati

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Figura 1. A. Schema della piastra di iniezione, che è fatta di agarosio e contiene un piccolo pozzetto per trattenere il pesce durante la microiniezione del morfinolino.

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Figura 2. Schema della microiniezione di morfolino. A. Posizionare il pesce nel piatto con la testa del pes...