Iniezione di Morpholino: un metodo per abbattere l'espressione genica bersaglio per studiare la funzione nel pesce zebra

Abstract

Fonte: Hyde D.R., et al. Elettroporazione in vivo di Morpholinos nella pinna caudale del pesce zebra adulto rigenerante. J. Vis. Exp. (2012)

Il protocollo descrive l'abbattimento mirato dell'espressione genica nel pesce zebra mediante iniezione di morfolino nella coda.

Protocol

1. Iniezione di Morpholino

1. Il giorno prima dell'iniezione del morpolino, fare una piastra per iniezione (Figura 1). Assicurati di ritagliare una tacca a un'estremità del pozzo, che aiuta a stabilizzare il pesce per la procedura di microiniezione.
2. Diluire il morpolino marcato con fluoresceina alla giusta concentrazione (si consiglia di iniziare con 1,2 mM) e porre a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti.
3. Caricare l'ago con il morfolino (nota: a seconda che si riempia o si carichi frontalmente, l'ago determinerà se si carica prima l'ago o se si taglia prima la punta).
4. Tagliare la punta dell'ago ad angolo.
5. Seguire le istruzioni del sistema di microiniezione per iniettare una bolla di morfolino di circa 5 nl per iniezione. Volumi maggiori di morfolino potrebbero distruggere il tessuto.
6. Anestetizzare il pesce e metterlo sulla piastra di iniezione. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e orientare l'ago nella posizione appropriata, appena distale al raggio osseo (Figura 2). Utilizzando un microscopio e un apparecchio per microiniezione appropriato per iniezioni di morfolino (vedere la tabella dei reagenti specifici), iniettare il morfinolino nella pinna da anteriore a posteriore, come mostrato nella Figura 2. L'iniezione da parte posteriore a quella anteriore provoca l'arrotolamento del tessuto della pinna durante l'iniezione ed è molto difficile.
7. Inserire delicatamente l'ago nel tessuto rigenerativo, appena distalmente a ciascun raggio osseo (contrassegnato con "1" nella Figura 2) e spingere distalmente fino a quando non si trova nel blastema (contrassegnato con "2" nella Figura 2). Fare attenzione a non spingere l'ago attraverso l'intera pinna. Quando l'ago è localizzato correttamente, iniettare il morfolino (cioè fare clic una volta). A 1,2 mM, la soluzione di morfolino marcata con fluoresceina appare giallo-verde, anche in condizioni di luce normali. Ad ogni iniezione, è possibile visualizzare un "soffio" giallo di soluzione di morfolino, che aiuta a localizzare l'iniezione nel blastema. Circa 75 nl (10-15 clic) di soluzione di morfolino devono essere iniettati per raggio osseo. Pausa ~ 1 secondo tra i clic. Iniettiamo solo il lato dorsale, usando il ventrale come controllo solo per l'elettroporazione.

Results

Figura 1. A. Schema della piastra di iniezione, che è fatta di agarosio e contiene un piccolo pozzetto per trattenere il pesce durante la microiniezione del morfinolino.

Figura 2. Schema della microiniezione di morfolino. A. Posizionare il pesce nel piatto con la testa del pes...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	Strumenti genetici, LLC		Morpholino dovrebbe essere progettato su misura per la tua proteina di interesse
Pompa di microiniezione	Strumenti di precisione del mondo, Inc.	PV830	PicoPump pneumatico È possibile utilizzare diversi sistemi di microiniezione
Micro-manipolatore	Strumenti di precisione del mondo, Inc.	MMJR	Destrorso (MMJL per mancino)
Aghi per microiniezione, diametro esterno 1,0 mm	Strumenti di precisione del mondo, Inc.	1B100F-4	Si tratta di capillari in vetro borosilicato, inseriti in un ago
Porta aghi	Strumenti di precisione del mondo, Inc.	5430-TUTTO	Kit ugelli Pico; assicurarsi di inserire la guarnizione della pipetta da 1,0 mm
Estrattore dell'ago	Sutter Instrument Co.	P-97	Anche altri estrattori di micropipette/aghi dovrebbero funzionare
microscopio	Leica, Nikon, Zeiss	Il numero varia a seconda del produttore	Qualsiasi stereomicroscopio con ottica 20X e capacità di lavorare con micromanipolatori
2-Fenossietanolo	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anestesia; diluire 1:1000 in acqua del sistema ittico per la procedura, 1:500 per l'eutanasia