Accoppiamento e stadiazione delle uova: un metodo per generare embrioni e ordinarli per fase di sviluppo

Abstract

Fonte: Hostelley T.L., et al. Preparazione del campione e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq da Zebrafish. J. Vis. Exp. (2017)

L'articolo descrive un protocollo per generare embrioni di zebrafish attraverso l'accoppiamento naturale e l'ordinamento delle loro fasi di sviluppo. Il protocollo viene utilizzato ulteriormente per l'analisi delle cellule β pancreatiche utilizzando pesci transgenici.

Protocollo

1. Generazione di embrioni attraverso l'accoppiamento naturale

1. Coltura di embrioni fino a 3 mesi di età, maturità riproduttiva.
2. Segregatare i pesci maschi e femmine adulti del ceppo desiderato in vasche di accoppiamento divise la sera prima della raccolta degli embrioni e aggiungere 2 maschi e 3 femmine a ciascuna vasca.
   NOTA: L'uso del ceppo reporter fluorescente transgenico insulin2a:mCherry ha permesso l'analisi delle cellule β pancreatiche.
3. Trasferire i pesci nella vasca di accoppiamento con acqua fresca del sistema e rimuovere il divisorio subito dopo l'accensione delle luci la mattina seguente.
4. Lasciare che i pesci si accoppino naturalmente fino a quando non si osservano embrioni nella vasca di fondo. Raccogli gli embrioni a intervalli di 30 minuti fino a quando non viene raccolta la quantità desiderata. Conservare ogni punto temporale raccolto in piastre di Petri separate in terreno embrionale a 28,5 °C.
5. Eseguire la microiniezione di materiale genetico o il posizionamento in terreni di coltura sperimentali, se lo si desidera, e coltivare gli embrioni nel terreno embrionale fresco di Hank in piastre di Petri da 10 cm a 28,5 °C.
   NOTA: Per l'analisi dell'espressione genica in animali iniettati con morfolino (MO) o mutanti, si noti che ogni manipolazione può avere impatti incidentali sull'espressione genica. I mutanti possono mostrare una compensazione genetica a livello di trascrizione che non è osservata dal targeting genico basato su MO.

2. Fase embrionali

1. Coltiva gli embrioni in gruppi di 50-75 embrioni per piastra di Petri da 10 cm per promuovere tempi di sviluppo coerenti di tutti gli embrioni.
2. Monitorare la morfologia dello sviluppo utilizzando il microscopio da dissezione negli stadi di blastomero, epibolia e somite per garantire la progressione dello sviluppo.
   NOTA: Rimuovere eventuali embrioni morenti o malformati per evitare ritardi nello sviluppo nel piatto.
3. Separare gli embrioni in base all'età di sviluppo. Stadiare gli embrioni e le larve utilizzando la lunghezza totale del corpo dopo 24 hpf.
   NOTA: I somiti sono il tessuto mesodermico a forma di chevron presente sulla parte dorsale dell'embrione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ins2a:mCiliegia	ZIRC	ZL1483
Serbatoi di accoppiamento Set di serbatoi incrociati da 1,0 litri	Acquaree	ZHCT100
Microscopio da dissezione	Zeiss