Estrazione del DNA dalla clip della coda: un metodo utilizzato nella genotipizzazione del pesce zebra

Abstract

Fonte: Xing L., et al. Genotipizzazione rapida ed efficiente del pesce zebra utilizzando la PCR con analisi del fuso ad alta risoluzione. J. Vis. Exp. (2014).

Questo articolo descrive l'estrazione del DNA dalla clip della coda del pesce zebra. Il protocollo dimostra un metodo rapido ed efficiente per analizzare i genotipi del pesce zebra.

Protocollo

1. Preparazione del DNA

1. Preparare il tampone per la lisi del DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Aggiungere la proteinasi K fresca a una concentrazione finale di 1 mg/ml il giorno dell'uso.
2. Raccolta dei tessuti:
   1. Per la clip a pinna di pesce adulto:
      1. Anestetizzare il pesce: Mettere il pesce in una soluzione di MS-222 (tricaina) allo 0,004%. Aspetta che il movimento delle branchie rallenti.
      2. Metti il pesce su una pila di 5-10 Kimwipes e taglia un pezzettino della pinna caudale, circa 2-3 mm, con una lametta sterile.
      3. Posizionare rapidamente il pesce in una vasca etichettata con acqua dolce per il recupero; etichettare accuratamente sia la vasca che il tubo corrispondente che conterrà la clip della pinna. Cambia l'acqua e dai da mangiare ai pesci a giorni alterni.
      4. Prelevare la clip dell'aletta con una punta per pipetta sterile e trasferirla in una provetta riempita con 100 μl di tampone per lisi del DNA.
      5. Gettare la punta della pipetta e gettare la lama del rasoio in un contenitore per oggetti taglienti.
   2. Per la clip della coda dell'embrione:
      1. Mettere gli embrioni in una soluzione di MS-222 (tricaina) allo 0,004%. Attendere 2 min.
      2. Tagliare un pezzo di coda con una pinza al microscopio da dissezione.
      3. Mettere la coda in una provetta marcata riempita con 30 μl di tampone di lisi del DNA.
      4. Mettere rapidamente l'embrione in una provetta contenente 100 μl di paraformaldeide al 4%.
      5. Etichettare i tubi con gli embrioni e i tubi di coda corrispondenti.
      6. Conservare le provette con gli embrioni a 4 °C per una notte per il fissaggio.
      7. Pulisci le pinze utilizzando acqua Milli-Q e Kimwipes tra ogni embrione per ridurre al minimo la contaminazione.
   3. Per gli embrioni interi:
      1. Mettere gli embrioni in una soluzione di MS-222 (tricaina) allo 0,004%. Attendere 2 min.
      2. Mettere 1-5 embrioni in una provetta riempita con 100 μl di tampone di lisi del DNA. La decorionazione non è necessaria.
3. Digestione del DNA
   Incubare le provette con tessuto (clip a pinna o coda o embrioni) a 55 °C per 4 ore fino a tutta la notte.
4. Inattivare la proteinasi K
   Le provette riscaldate a 95 °C per 15 minuti Il DNA deve essere utilizzato immediatamente per la PCR o conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaina
Paraformaldeide