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1. Preparazione degli embrioni
- Dopo l'accoppiamento, raccogliere gli embrioni in E3 in una capsula di Petri e incubarli a 26,5 °C per circa 28 ore prima di montarli.
nota: Questo rallenta lo sviluppo degli embrioni in modo che gli embrioni siano approssimativamente allo stadio di 30 somite all'inizio dell'imaging.
- Anestetizzare gli embrioni in tricaina 0,016-0,020% in E3. Per inibire la pigmentazione, aggiungere PTU a una concentrazione di 200 μM.
- Dechorionare gli embrioni usando una pinza al microscopio da dissezione. Usando due pinze, afferrare e separare delicatamente il corion per rilasciare l'embrione.
2. Montaggio in agarosio
NOTA: Il metodo di montaggio sviluppato richiede due diverse concentrazioni di agarosio a basso punto di fusione in E3 con lo 0,02% di Tricaina e PTU secondo necessità. La prima soluzione di agarosio contiene una concentrazione ottimale di agarosio alla quale la distorsione e la motilità sono al minimo. L'ottimizzazione è descritta nel passaggio 5 di seguito.
- Riscaldare le soluzioni di agarosio per i due strati (concentrazione definita al punto 5 e 1%) a 65 °C. Lasciare raffreddare l'agarosio a circa 30 °C poco prima del montaggio in modo che l'embrione non venga danneggiato dal calore. Per il montaggio, utilizzare piatti con fondo in vetro da 35 mm con fondo in vetro di copertura n. 0. Il vetro di copertura attaccato al fondo del piatto crea un pozzetto poco profondo di 10 mm (circa 1,2 mm) in cui deve essere collocato l'embrione.
nota: In questo caso, la concentrazione con la minore motilità e distorsioni era compresa tra lo 0,025 e lo 0,040% di agarosio.
- Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei lati verso il fondo del piatto utilizzando una pipetta di vetro o una micropipetta. Se si utilizza una micropipetta, tagliare la parte esterna della punta per aumentare le dimensioni dell'apertura per adattarla all'embrione (Figura 1A). Rimuovere con cautela l'eventuale E3 rimanente con una micropipetta.
- Aggiungere la prima soluzione di agarosio al piccolo pozzetto creato dal vetro di copertura attaccato al fondo del piatto per coprire l'embrione (Strato 1) (Figura 1B). Assicurati che l'agarosio copra il pozzetto piccolo ma non trabocchi.
- Coprire il pozzetto piccolo con un vetro di copertura (22 mm x 22 mm) (Figura 1C) per creare uno stretto spazio pieno di agarosio con l'embrione tra i due vetri di copertura.
- Mettere uno strato di soluzione di agarosio all'1% sopra il vetro di copertura su tutto il fondo del piatto (Strato 2) (Figura 1D). Man mano che questo strato si solidifica, mantiene in posizione il vetro di copertura.
- Riempire la parte rimanente del piatto con E3 contenente lo 0,02% di tricaina per mantenere il sistema idratato (Strato 3) (Figura 1E).
nota: In questa configurazione, il vetro di copertura e l'agarosio all'1% proteggono lo strato inferiore dalla diluizione.
3. Ottimizzazione della soluzione di agarosio per lo strato 1
- Per identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato 1, utilizzare un approccio di ricerca su griglia multiscala. Montare gli embrioni in concentrazioni crescenti di agarosio comprese tra lo 0,01% e l'1%, seguite da immagini time-lapse della restrizione della crescita e della motilità dell'embrione nel campo visivo. Identificare le concentrazioni in cui sia la distorsione che la motilità sono al minimo.
- Per ottimizzare ulteriormente la concentrazione di agarosio, montare gli embrioni utilizzando una gamma più fine di concentrazioni di agarosio (ad esempio, tra lo 0,025 e lo 0,040% di agarosio) a seconda della concentrazione risultata migliore nella fase 3.1 (ad esempio, 0,025%, 0,028%, 0,031%, ecc.).
nota: Nel nostro laboratorio, la concentrazione ottimale di agarosio era di circa lo 0,03%.
