1. Configurazione del microscopio, acquisizione, elaborazione e analisi delle immagini
- Preparare l'agarosio allo 0,8% a basso punto di fusione (LMP): aggiungere 0,8 g di agarosio LMP a 100 ml di E3 e scaldare fino a completa dissoluzione. A caldo, aliquotare 1 ml di agarosio LMP in provette per microfugi da 1,5 ml in un blocco riscaldante a 37 °C. L'agarosio LMP rimarrà fuso a 37 °C. Aggiungere 40 μl di tricaina a 4 mg/ml (25x), pH 7,0 a ciascuna aliquota di 1 ml di agarosio LMP a 37 °C. NOTA: Se si lavora con un ceppo pigmentato, aggiungere 20 μl di PTU allo 0,15% (50x) a ciascuna aliquota da 1 ml.
- Conservare l'agarosio LMP rimanente per diversi mesi in provette sigillate da 50 ml a 4 °C.
- Anestetizzare gli embrioni parabiotici da visualizzare aggiungendo 1 ml di tricaina a 4 mg/ml (25x), pH 7,0 ai 25 ml di E3 in cui si trovano già gli embrioni.
- Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni si accumulino al centro. Quindi, utilizzando una pipetta di plastica a punta larga, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile. Capovolgere la pipetta in posizione verticale e far rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che si depositino sul fondo della pipetta.
- Con gli embrioni sul fondo della pipetta, trasferirli in un'aliquota di 1 ml di agarosio LMP toccando leggermente la punta della pipetta sulla superficie dell'agarosio. Evitare di trasferire il liquido in eccesso in quanto ciò diluirebbe l'agarosio.
- Dopo aver espulso il liquido in eccesso dalla pipetta, utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni all'interno dell'agarosio, quindi utilizzare la pipetta per trasferire tutto l'agarosio e gli embrioni nel pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con fondo di vetro (n. 1,5 vetrino coprioggetti.
nota: Assicurarsi di gettare la pipetta dopo aver trasferito gli embrioni nella piastra ai fosfori. L'agarosio residuo si depositerà all'interno della pipetta, rendendola inefficace per un ulteriore utilizzo. Piuttosto, usa una nuova pipetta ogni volta.
- Sotto uno stereoscopio, utilizzare una punta di pipetta con caricamento di gel fissata all'estremità di un ago da presa con manico in legno per posizionare gli embrioni verso il vetro di copertura (per assicurarsi che si trovino entro la distanza di lavoro dell'obiettivo del microscopio) e nell'orientamento desiderato per l'imaging><.
nota: Riposizionare continuamente fino a quando l'agarosio non si è completamente solidificato. Fare attenzione a montare gli embrioni parabiotici in base all'embrione della coppia da riprendere. Dato l'orientamento casuale degli embrioni siamesi, per alcune coppie può essere difficile visualizzare entrambi gli embrioni. In questo scenario, recuperare gli embrioni dall'agarosio utilizzando una pinza e una pipetta di trasferimento in plastica a punta larga e quindi rimontarli per l'imaging da una prospettiva diversa.
- Una volta che l'agarosio si è solidificato, coprire con 2 - 3 ml di E3 integrato con tricaina (e PTU se necessario).
- Visualizzare gli embrioni utilizzando un microscopio confocale a epifluorescenza a campo largo invertito, confocale a scansione laser o a disco rotante. Selezionare l'obiettivo più appropriato per l'imaging desiderato. Per un campo visivo dell'intero embrione, utilizzare un obiettivo 4x. Selezionare un ingrandimento maggiore, ad esempio un obiettivo 20x, per visualizzare un tessuto specifico
nota: Se si utilizza un microscopio verticale, montare l'agarosio LMP (simile a quello sopra) su un vetrino coprioggetti in vetro. Capovolgere il vetrino coprioggetti su un vetrino da microscopio che abbia un anello di grasso sottovuoto riempito con lo stesso E3-tricaina-PTU.
- Elabora le immagini acquisite utilizzando pacchetti software gratuiti per l'analisi delle immagini come NIH Image J/FIJI.
nota: Conta il numero di cellule e quantifica dinamiche come la migrazione e la divisione cellulare utilizzando algoritmi di segmentazione e tracciamento.
