Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

1: Assotomia a due fotoni utilizzando un microscopio a due fotoni costruito su misura con un laser Chameleon Ti-Sapphire

1. Preparati per l'imaging. Posizionare l'embrione o gli embrioni montati su un supporto per vetrini sotto il microscopio. Concentrati su un embrione con un obiettivo d'acqua 40X (0,8 NA). Accendi il laser. Siamo stati in grado di visualizzare e danneggiare in modo riproducibile i neuroni che esprimono GFP utilizzando i seguenti parametri. Per visualizzare gli assoni a una potenza non dannosa, impostare il laser su una lunghezza d'onda di 910 nanometri (nm) e una potenza di 30 milliwatt (mW elencati sono la quantità di potenza al campione). Aprire il software di imaging. Utilizziamo il software ScanImage sviluppato nel laboratorio di Karel Svoboda.
2. Premi la messa a fuoco per scansionare l'embrione con il laser a due fotoni, individuare l'assone che desideri assotomizzare e acquisire un'immagine di questo assone. Segna la prima e l'ultima posizione Z, acquisisci l'immagine e fai una proiezione massima delle pile Z.
3. Ingrandisci di 70X il ramo dell'assone che desideri assotomizzare e interrompi la scansione. Aumentare il mW sul campione fino alla potenza dannosa di 180 mW ed eseguire una singola scansione con il laser. Lo facciamo impostando il numero di fette Z su 1 e premendo "Grab". Questo dovrebbe essere sufficiente per recidere l'assone. Vedere la discussione per i metodi per ottimizzare questa procedura per il microscopio e l'obiettivo sperimentale.
4. Rimpicciolire, ridurre la potenza a 30 mW e scattare un'immagine.

2: Assotomia a due fotoni su microscopio confocale/a due fotoni Zeiss 510

1. Posiziona l'embrione montato sul tavolino e mettilo a fuoco utilizzando un obiettivo ad acqua 25X o un altro obiettivo adatto.
2. Accendi i laser a due fotoni (910 nm) e Argon (488 nm) in un'impostazione multitraccia in modo che sia possibile passare da uno all'altro. Sebbene entrambi i laser vengano utilizzati per rilevare la GFP, l'emissione a due fotoni viene visualizzata in rosso e l'emissione laser ad argon in verde per differenziare le due.
3. Usa il laser ad argon per identificare un assone da ferire. Nelle impostazioni Z contrassegnare la prima e l'ultima sezione ottica. Prendi un'immagine confocale e crea una proiezione massima dello stack Z.
4. Scegli la regione dell'assone da ferire e metti a fuoco questa regione. Spegni il laser ad argon e accendi il laser a due fotoni. Scansiona il campione con i due fotoni a un'intensità laser di ~9% di trasmissione per assicurarti che l'assone sia ancora a fuoco.
5. Fare clic sul pulsante "stop" in modo che lo strumento di ritaglio sia disponibile. Utilizzare il ritaglio per ingrandire l'area di interesse. Di solito ingrandiamo a ~70X (lo zoom può essere controllato nella scheda "modalità"). Nella scheda "canali" cambia l'intensità dei due fotoni da ~9% di trasmissione a 15-20% di trasmissione.
6. Per recidere un assone, attivare il pulsante "fast XY" per circa 1 secondo, quindi premere il pulsante di arresto per evitare danni eccessivi. L'assone dovrebbe essere visto come detriti sparsi se la procedura ha funzionato.
7. Per assicurarsi che l'assone sia stato danneggiato, tornare al laser ad argon a 488 nm, scattare un'altra immagine confocale e creare una proiezione massima.