$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Larve montate per esperimenti comportamentali
- Preparare l'1,5% di agarosio a basso punto di fusione in ddH2O e conservare in un blocco termico a 42 °C per evitare che si solidifichi.
- Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, trasferire una delle larve pre-selezionate in un tubo di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% con meno acqua blu/embrionale possibile.
- Trasferire le larve in una goccia di agarosio su una piccola capsula di Petri.
- Sotto un microscopio da dissezione, posizionare la larva dorsalmente verso l'alto.
- Quando l'agarosio si è solidificato, taglialo via con una lama di rasoio sottile (bisturi #11), lasciando uno spicchio di agar attorno all'intera larva.
- Fate due tagli diagonali ai lati del tuorlo; fate attenzione a non intaccare la larva.
- Riempire l'area circostante l'agarosio con embrione/acqua blu.
- Allontanare l'agarosio dal tronco e dalla coda della larva (Figura 1).
2 . Preparazione della fotocamera ad alta velocità e del software di imaging
- Montare la telecamera ad alta velocità sul cannocchiale da dissezione.
- Collegare la fotocamera al computer.
- Accendi il computer.
- Accendi la fotocamera ad alta velocità.
- Apri il software di video/imaging (utilizziamo il software di imaging AOS e descriveremo le procedure per utilizzarlo qui, ma altri software di imaging sono ugualmente accettabili).
- Regola le impostazioni della fotocamera di conseguenza (ad es. 1.000 fotogrammi al secondo (fps), buffer di attivazione del 50% o altre impostazioni preferite).
- Avvia la registrazione.
3. Attiva singoli neuroni utilizzando un laser a 473 nm
- Collegare lo stimolatore, il laser e il cavo ottico.
- Accendi lo stimolatore.
- Impostare lo stimolatore su un massimo di 5 Volt e una durata dell'impulso di 5 msec.
- Accendere il laser secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare un microscopio da dissezione per posizionare la punta del cavo ottico vicino al corpo cellulare di un neurone con espressione ChEF-tdTomato (Figura 1).
- Eroga un impulso di luce blu per attivare il neurone sensoriale.
- Registra il comportamento utilizzando una telecamera ad alta velocità impostata su 500 o 1.000 fotogrammi al secondo.
- Ripetere l'esperimento come desiderato, aspettando 1 minuto tra ogni attivazione per evitare l'assuefazione. (Registriamo un minimo di tre risposte per ogni neurone).
- Per liberare le larve, staccare l'agarosio con una pinza, facendo attenzione a non ferire l'animale. Questo animale può essere lasciato sviluppare ulteriormente e la procedura può essere ripetuta in una fase più avanzata per caratterizzare lo sviluppo del comportamento. L'embrione può anche essere rimontato per l'imaging confocale ad alta risoluzione della cellula attivata per correlare il comportamento con la struttura cellulare, come descritto di seguito.
- Trasferire la larva sulla piastra di coltura con acqua fresca blu/embrione. Utilizziamo una piastra a 24 pozzetti per tenere traccia delle singole larve.
