Dissezione del cristallino: una tecnica per osservare la morfologia del cristallino del pesce zebra

In questo articolo

Abstract

Fonte: Vorontsova I. et al, Valutazione della localizzazione del nucleo della lente di zebrafish e dell'integrità suturale. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive il protocollo sviluppato per sezionare lenti adulte e larvali di zebrafish per analizzare la morfologia delle lenti corticali e l'integrità strutturale delle suture delle lenti.

Protocollo

1. Dissezione di lenti larvali e adulte di pesce zebra

Anestetizzare i pesci dalle larve di 6 dpf all'età adulta con la tricaina fino a quando non rispondono al tatto ma mostrano ancora un forte battito cardiaco. Misurare la lunghezza standard del pesce secondo Schilling (2002) per l'allestimento.
Asportare immediatamente gli occhi utilizzando le forbici per microdissezione e metterli in una capsula di dissezione in PBS (Figura 1 mostrata per gli occhi adulti).
1. Crea un piatto personalizzato da 35 mm riempito di silicone per la dissezione delle lenti. Una volta che il silicone si è solidificato, asportare un divot di circa 2-3 mm di diametro e 0,5 mm di profondità per immobilizzare gli occhi/le lenti degli adulti durante la dissezione.
Dissezione di lenti adulte di pesce zebra
1. Metti un occhio adulto nel piatto con il lato posteriore rivolto verso l'alto riempito di PBS. Immobilizzare l'occhio inserendo una pinza con un angolo di <45° attraverso il disco ottico. Fare attenzione a non intaccare o comprimere l'obiettivo. Praticare due o tre incisioni radiali attraverso la retina e la sclera dal disco ottico alla zona ciliare con le forbici da dissezione.
2. Staccare la retina e la sclera come petali di fiori e capovolgere l'occhio, con la cornea rivolta verso l'alto. Immobilizzare il cristallino indirettamente tramite la manipolazione della sclera e della cornea con il lato piatto delle forbici, mentre si tira via la retina e i tessuti attaccati con una pinza. Tagliare con cura il tessuto in eccesso dalla lente.
  nota: È fondamentale sezionare con attenzione per ottenere lenti costantemente sane.
Dissezione delle lenti larvali di zebrafish
1. Posizionare un occhio larvale con il lato posteriore rivolto verso l'alto sulla parte piatta del piatto di silicone riempito di PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per eseguire tagli radiali attraverso la retina e la sclera mentre immobilizza l'occhio con un altro ago di tungsteno o una pinza.
  nota: Fare attenzione a non danneggiare l'obiettivo.
  1. Affilare elettroliticamente la punta di un filo di tungsteno da 0,1 mm di lunghezza di 2 cm sospendendo la punta del filo in NaOH al 10% (p/v) e applicando una corrente alternata a bassa tensione14. Fissare l'ago in una pipetta Pasteur fondendo l'estremità di vetro con un bruciatore Bunsen.
    nota: È possibile utilizzare anche strumenti alternativi di dissezione fine.
    cautela: Il NaOH è corrosivo.
2. Estrarre delicatamente la lente dall'occhio dissociato con un lato smussato dell'ago e tirare via con cautela il tessuto attaccato.

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Risultati

Immagini al microscopio per dissezione occhio di pesce; viste anteriori/posteriori, rimozione della lente, barre della scala da 2 mm.
Figura 1: Dissezione della lente del pesce zebra. (A) Gli occhi vengono sezionati da pesci anestetizzati e posizionati posteriormente verso l'alto (B). (C) Gli occhi vengono immobilizzati da una pinza attraverso il disco ottico (od) e vengono pr...