Elettrofisiologia del pesce zebra adulto: un metodo per misurare l'attività elettrica extracellulare dei neuroni in vivo

Abstract

Fonte: Johnston, L., et al. Registrazione elettrofisiologica nel cervello di zebrafish adulti intatti. J. Vis. Exp. (2013)

Il protocollo descrive la procedura per eseguire l'elettrofisiologia nel pesce zebra adulto. Questo metodo può essere utilizzato per misurare l'attività neurale in vivo.

Protocollo

1. Elettrofisiologia

1. Chiudere il rubinetto di arresto dell'intubazione e scollegare rapidamente il Luer lock che collega la base di intubazione al gocciolatoio della tricaina.
   1. Spostare la configurazione di intubazione intatta sul microscopio elettrofisiologico e collegarla al sistema di perfusione.
   2. Aprire l'acqua dell'habitat e perfondere a una velocità di 1 ml/min per ~1 ora, al fine di lavare via la tricaina.
2. Utilizzando un micromanipolatore sotto controllo visivo, posizionare l'elettrodo secondario in modo che la punta dell'elettrodo possa essere inserita nella narice dell'animale o nell'avvallamento dietro la mascella superiore.
3. Inserire l'ago dell'elettrodo primario nell'apertura della craniotomia. Inserire l'ago nel fazzoletto, in modo che la punta sia posizionata abbastanza superficialmente all'interno del tectum ottico.
   1. Se l'elettrodo è troppo profondo, il segnale elettrico potrebbe essere piccolo.
4. Raccogliere e analizzare la differenza elettrica registrata tra gli elettrodi di riferimento primari e secondari. Questo processo consentirà di ottenere registrazioni extracellulari.
   1. Raccogli i dati in modalità Gap-free a una frequenza di campionamento di 5 kHz, con un filtro passa-basso di 0,1 kHz e un filtro passa-alto di 1 Hz.
   2. Non iniziare a registrare l'attività elettrofisiologica fino a quando l'acqua dell'habitat non si è perfusa per un minimo di 45 minuti.
   3. Registrare un basale di attività nativa per almeno 15 minuti prima dell'aggiunta di farmaci sperimentali. Iniziare la perfusione con farmaci sperimentali di scelta e registrare per il periodo di tempo desiderato. Nelle preparazioni sane, è possibile registrare l'attività neurologica per 2-3 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Habitat acqua			pH 7,0-7,4, conducibilità di 400-450 μS; gestito da Instant Ocean e Bicarbonato di sodio
Tricaina tris-tamponata allo 0,4%	Sigma-Aldrich	E10521	pH 7,2-7,4; conservato a -20 oC
Provette siringa Luer lock da 60 ml	Becton, Dickinson e compagnia	309653
Rubinetti a 3 vie con connessioni Luer
0.010 in Filo d'argento	A-M Systems, Inc.
Portaelettrodo serie Q
Fisherbrand Piastra Petri da 100 mm x 15 mm	Fisher Scientifico	NC9299146
34 g Ago smussato	Strumenti di precisione del mondo, Inc.	NF34BV
37 cm x 42 cm Kimwip	Kimberly-Clark Professionista	TW31KEM
Tubo da 1/8 di pollice di diametro
Tubo diametro 1 mm
Microscopio (Leica MZ APO)	È possibile utilizzare un altro microscopio