Iniezione intramuscolare (IM): Somministrazione di composto nel muscolo dorsale di un pesce zebra adulto

Abstract

Fonte: Myllymäki, H., et al. Immunizzazione di pesce zebra adulto per lo screening preclinico di vaccini basati sul DNA. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive la tecnica di iniezione intramuscolare per la somministrazione di composti nei muscoli dorsali di un pesce zebra adulto.

Protocollo

1. Iniezione del vaccino a DNA ed elettroporazione

1. Per le vaccinazioni secondo questo protocollo, utilizzare pesce zebra adulto sano, di età compresa tra 6 e 12 mesi. Tenere i pesci in un sistema a flusso continuo con un ciclo luce/buio di 14/10 ore, con un massimo di sette pesci per 1 litro d'acqua.
2. Preparare una soluzione di estere etilico (tricaina) dell'acido 3-amminobenzoico allo 0,02% (pH 7) nell'acqua della vasca per anestetizzare il pesce. Usa una capsula di Petri da 10 cm o qualcosa di simile.
3. Preparare un serbatoio di recupero riempiendo un becher da 5 L con 3 L di acqua pulita dell'impianto.
4. Preparare un'imbottitura per le vaccinazioni per mantenere il pesce in una posizione fissa durante la vaccinazione. Prendi un pezzo di 5 x 7 cm² di una spugna spessa da 2 a 3 cm. Taglia un solco nella spugna con una lama di bisturi o forbici affilate.
   nota: La stessa imbottitura per la vaccinazione può essere utilizzata in più esperimenti. Disinfettare la spugna tra gli esperimenti immergendola in alcol etilico al 70% e lasciare asciugare.
5. Immergere accuratamente la spugna nell'acqua del sistema e posizionare la spugna su una piastra di Petri.
6. Digiunare il pesce 24 ore prima delle vaccinazioni.
7. Anestetizzare un pesce zebra posizionandolo su una capsula di Petri contenente lo 0,02% di tricaina. Attendere che il pesce non risponda alla stimolazione tattile e che non ci sia alcun movimento delle branchie. Anestetizzare un singolo pesce alla volta.
8. Usando un cucchiaio di plastica, trasferisci il pesce zebra anestetizzato sulla spugna bagnata e posiziona il lato ventrale del pesce verso il basso nella scanalatura. Nella posizione corretta, assicurarsi che la testa e la maggior parte del corpo del pesce siano all'interno della scanalatura e che la pinna dorsale e la coda sporgano dalla scanalatura.
9. Al microscopio, posizionare con cautela l'ago con un angolo di circa 45° vicino al muscolo dorsale del pesce zebra, utilizzando le rotelle di regolazione fine degli assi x e y sul micromanipolatore.
10. Trova il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale, dove spingere l'ago non richiede forza. Se si avverte resistenza, provare un punto adiacente. Evitare di ferire la colonna vertebrale, la pinna dorsale o le squame.
    nota: Se l'ago si piega durante la spinta, accorciare leggermente l'ago tagliandolo.
11. Utilizzare l'interruttore a pedale per iniettare gradualmente la soluzione vaccinale nel muscolo. Osservare l'iniezione al microscopio: il rosso fenolo è visibile quando entra nel tessuto muscolare. Se necessario, regolare la durata dell'impulso.
    nota: In alternativa, utilizzare il pulsante dell'iniziatore di impulsi sul pannello frontale della pompa pneumatica per l'iniezione. Tuttavia, l'uso di un interruttore a pedale remoto consente di utilizzare l'altra mano per regolare la lunghezza dell'impulso tramite la rotella a 10 giri. Evitare di iniettare la soluzione troppo velocemente, poiché ciò potrebbe causare danni eccessivi ai tessuti. Assicurarsi di non iniettare aria.
12. Elettroporare il pesce subito dopo l'iniezione. Assicurati che il pesce sia ancora sotto anestesia. Tenere il pesce sulla spugna e posizionarlo tra gli elettrodi a pinzetta, in modo che gli elettrodi si trovino su ciascun lato del sito di iniezione. Non premere troppo forte la pinzetta degli elettrodi, ma mantenere entrambi gli elettrodi a contatto con il pesce.
    1. Premere il pulsante di avvio sull'elettroporatore per emettere sei impulsi da 40 V, 50 ms.
    2. Trasferire delicatamente il pesce nella vasca di recupero.
    3. Pulire gli elettrodi dopo ogni elettroporazione passandoli con etanolo al 70%.
       nota: Monitorare attentamente il benessere dei pesci dopo la vaccinazione. Sopprimere qualsiasi pesce che mostri segni di disagio (un lento recupero dall'anestesia, nuoto aberrante, ansimare) in tricaina allo 0,04%. Dopo il recupero, trasferire il pesce nell'unità a flusso continuo e alimentarlo normalmente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fenolo rosso sale sodico	Sigma-Aldrich	Codice 114537-5G
Tricaina (sale di etil 3-amminobenzoato metanosolfonato)	sigma	A5040-100g	soluzione per anestesia ed eutanasia
Pinzette Elettrodi (7 mm) Kit	Apparato BTX Harvard	BTX 450165	Elettrodi tipo pinzetta
Capillari alluminosilicati	Apparato di Harvard	30-0108
Micromanipolatore	Narishige	MA-153
microscopio	Olimpo	ZS61
ECM Electro Square Porator	Apparato BTX Harvard	BTX ECM 830
Cucchiaio di plastica
spugna
Banco da lavoro in polistirolo