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Abstract

Fonte: Luukinen, H., et al. Modellazione della tubercolosi nel pesce zebra adulto infetto da Mycobacterium marinum. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive una tecnica di iniezione intraperitoneale, un metodo per somministrare soluzioni nella cavità addominale di un pesce zebra adulto.

Protocol

1. Infezione sperimentale da M. marinum con iniezione intraperitoneale

1. Pipettare una goccia da 5 μl della soluzione batterica diluita su un pezzo di pellicola di parafilm e tirare la gocciolina in un ago da insulina da 30 G.
2. Per l’esperimento, utilizzare pesci selvatici di 5-8 mesi e pesci mutanti rag1-/-hu1999. Anestetizzare il pesce zebra adulto nell’acqua della vasca con estere etilico dell’acido 3-amminobenzoico allo 0,02% (pH 7,0). Posizionare il pesce con il lato ventrale rivolto verso l’alto in una fessura su una plastica espansa umida.
   NOTA: I pesci straccioni mutanti non sono in grado di subire ricombinazione somatica e produrre cellule T e B funzionali.
3. Iniettare l’ago tra le pinne pelviche con un angolo di circa 45°. Tenere l’apertura dell’ago verso l’alto per osservare che l’intera apertura si trova all’interno della cavità addominale. Iniettare lentamente la sospensione batterica e rimuovere con cautela l’ago.
   nota: Nel caso in cui il tracciante rosso fuoriesca dal pesce al momento dell’iniezione, escludere il pesce dall’esperimento.
4. Subito dopo l’iniezione, trasferire il pesce in una vasca di recupero con acqua fresca.
5. Prelevare campioni della sospensione batterica su piastre 7H10 ogni 15 minuti dall’aliquota batterica in uso e incubare i batteri a 29 °C per 5 giorni e verificare la dose di infezione contando le colonie sulle piastre.
6. Controllare regolarmente il benessere dei pesci e sopprimere tutti i pesci con sintomi dell’infezione con una concentrazione superiore allo 0,02% di estere etilico dell’acido 3-aminobenzoico (pH 7,0).
   nota: Approssimativamente, il 7% degli zebrafish adulti infettati con 34 ± 15 CFU e il 30% degli zebrafish infettati con 2029 ± 709 CFU avranno avuto sintomi entro 8 settimane. I sintomi possono includere nuoto anomalo, mancanza di risposta al tatto, respiro affannoso, edema o deperimento osservabile.
7. Mantenere il pesce zebra secondo gli standard comuni.

Materials

Mycobacterium marinum 	American Type Culture Collection 	ATCC 927
Phenol red	Sigma-Aldrich	P3532
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Middlebrock 7H10 agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	A5040
Omnican 100 30 G insulin needle	Braun	9151133
1 mL syringe	Henke Sass Wolf	4010.200V0