Microiniezione di embrioni: una tecnica per somministrare un composto nel tuorlo di pesce zebra

Abstract

Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produzione efficiente e identificazione di knockout genici generati da CRISPR/Cas9 nel sistema modello Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive una tecnica di microiniezione di embrioni per rilasciare composti nel sacco vitellino di pesce zebra.

Protocollo

1. Microiniezione di componenti CRISPR in embrioni di pesce zebra

1. Allestisci le vasche di riproduzione la notte prima dell'iniezione posizionando il numero di maschi e femmine desiderati (in genere 2 femmine e 1 o 2 maschi) in una vasca di riproduzione con un divisore in posizione.
2. Preparare una piastra per microiniezione con agarosio all'1,5% in 1 terreno E3 (vedere la Tabella dei materiali) con blu di metilene allo 0,01% (un fungicida) versando 35 ml di agarosio fuso in una piastra di Petri da 10 cm e stendere delicatamente uno stampo di plastica per creare trogoli a forma di cuneo nella soluzione, picchiettando lo stampo per e....

Risultati

Figura 1: Confronto dello stato di salute di 24 embrioni iniettati hpf. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, è facilmente distinguibile da un embrione che ha abortito lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano a (B) o hanno caratteristiche drasticamente alterate rispetto a (A), come la curvatura spinale o lo sviluppo alterato della testa e degli occhi, devono essere rimossi dal piatto

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua priva di RNasi	Qualsiasi marca		Sintesi di RNA guida. Thermo Fisher e Qiagen portano entrambi acqua adatta.
Terreno embrionale E3	Fatto in casa		Terreni per l'allevamento di embrioni e fare injeciton plate. Ricetta: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M9140	Aggiunto a 1x terreno E3 per prevenire la crescita fungina sugli embrioni.
Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Conservare gli embrioni, piastra per iniezione fusa
agarosio	Denville	CA3510-8	Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
Stampo per microineczione	Strumenti di scienza adattiva	TU-1	Per creare pozzetti per contenere gli embrioni durante l'iniezione
Rosso fenolo	Sigma-Aldrich	P0290	Colorante per la visualizzazione dell'iniezione
olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Per calibrare il volume di iniezione dell'ago.
Pipette di trasferimento	Qualsiasi marca		Spostamento di embrioni
lametta	Thermo Fisher	Codice 11295-10	Taglio dell'ago per iniezione, taglio della coda del pesce adulto.
incubatrice			Mantenimento degli embrioni a 28,5 C.
Estrattore per pipette a verticola	David Kopf Strumenti	700C	Generare aghi per iniezione. Istruzioni aggiuntive per l'estrazione dell'ago: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubi capillari	Strumenti Sutter	BF100-58-10	Generare aghi per iniezione.
Punte per microloader	Eppendorf	930001007	Caricare la soluzione negli aghi per iniezione
Microiniettore	Strumenti di precisione mondiali	PV 820	Iniezione di embrioni.
Microscopio dissezionante	Leica		Iniezione di embrioni.
microonde	Qualsiasi marca		Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
scala	Qualsiasi marca		Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
guanti	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
N2	Qualsiasi marca		Per espellere il liquido dal capillare per l'iniezione di embrioni
Provette per strisce PCR	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Puntali da 200 μl	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Puntali da 10 μl	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Micropipette	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.