Microiniezione di embrioni: una tecnica per somministrare un composto nel tuorlo di pesce zebra

Abstract

Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produzione efficiente e identificazione di knockout genici generati da CRISPR/Cas9 nel sistema modello Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive una tecnica di microiniezione di embrioni per rilasciare composti nel sacco vitellino di pesce zebra.

Protocollo

1. Microiniezione di componenti CRISPR in embrioni di pesce zebra

1. Allestisci le vasche di riproduzione la notte prima dell'iniezione posizionando il numero di maschi e femmine desiderati (in genere 2 femmine e 1 o 2 maschi) in una vasca di riproduzione con un divisore in posizione.
2. Preparare una piastra per microiniezione con agarosio all'1,5% in 1 terreno E3 (vedere la Tabella dei materiali) con blu di metilene allo 0,01% (un fungicida) versando 35 ml di agarosio fuso in una piastra di Petri da 10 cm e stendere delicatamente uno stampo di plastica per creare trogoli a forma di cuneo nella soluzione, picchiettando lo stampo per eliminare le bolle d'aria.
3. Lasciare solidificare l'agarosio e conservare il piatto con una piccola quantità di terreno e avvolgerlo in una pellicola di paraffina per evitare che il piatto si asciughi a 4 °C.
   nota: Le piastre di iniezione sono riutilizzabili per diverse settimane, fino a quando i pozzetti non si deformano o si asciugano, o la piastra inizia a svilupparsi come muffa.
4. La mattina dell'iniezione, scongelare l'sgRNA purificato e la proteina Cas9 su ghiaccio. Ricordarsi di maneggiare tutti i materiali con i guanti per prevenire la contaminazione da RNasi e di utilizzare puntali e tubi privi di RNasi.
5. Generare una soluzione iniettabile da 5 μL combinando la proteina Cas9 e l'sgRNA in un rapporto 2:1 di Cas9:sgRNA per ottenere concentrazioni finali di 400 pg/nL di proteina Cas9 e 200 pg/nL di sgRNA. Incubare la soluzione di Cas9/sgRNA a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire a Cas9 e sgRNA di formare un complesso ribonucleoproteico. Aggiungere 0,5 μl di soluzione di rosso fenolo al 2,5% in peso/volume (vedere la tabella dei materiali) e acqua priva di RNasi fino a un volume finale di 5 μl.
   nota: È stato dimostrato che la forza ionica della soluzione influenza la solubilità del complesso Cas9/sgRNA, quindi l'aggiunta di KCl può aumentare l'efficienza di taglio degli sgRNA che mostrano una bassa formazione di indel.
6. Realizzare un ago per iniezione tirando un capillare di vetro da 1,0 mm utilizzando un estrattore per micropipette. Taglia la punta dell'ago appena fatto usando una nuova lama di rasoio o una pinza per ottenere un'apertura angolata che forerà facilmente il corion e il sacco vitellino.
7. Posizionare l'ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore con la fonte d'aria accesa. Al microscopio ottico utilizzando l'ingrandimento adatto alla calibrazione determinata per il particolare apparato, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle costantemente una soluzione da 1 nL in una piastra di Petri riempita con olio minerale.
   nota: La qualità dell'ago è fondamentale. Esercitati a produrre un ago e a iniettarlo nel sacco vitellino degli embrioni fino a quando questa abilità non è padroneggiata prima di tentare ulteriori esperimenti.
8. Rimuovere il divisore e lasciare che il pesce si riproduca per circa 15 min.
   nota: Tempi di riproduzione più lunghi produrranno più embrioni, tuttavia l'iniezione dovrebbe essere completata mentre gli embrioni sono allo stadio di 1 cellula per massimizzare la possibilità che il taglio di Cas9 avvenga precocemente e quindi ridurre il mosaicismo genetico. Gli embrioni possono essere iniettati in fasi successive (2-4 stadi cellulari), ma questo può eventualmente ridurre la velocità di trasmissione germinale dell'allele modificato.
9. Raccogliere le uova con un colino e sciacquarle in una capsula Petri da 10 cm utilizzando 1 terreno E3 con blu di metilene allo 0,0001%. Esamina la salute delle uova al microscopio ottico, rimuovendo eventuali uova e detriti non fecondati.
10. Mettere da parte 10-15 embrioni come controllo non iniettato in una capsula di Petri separata ed etichettata.
11. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare delicatamente le uova sulla piastra di iniezione riscaldata a temperatura ambiente.
12. Sotto un microscopio da dissezione con ingrandimento 2,5X, iniettare 1 nL della soluzione nel sacco vitellino di ciascun embrione per iniettare un totale di 400 pg di proteina Cas9 e 200 pg di sgRNA.
    nota: Per aumentare il taglio, se lo si desidera o se necessario, aumentare la concentrazione finale della proteina Cas9 a 800 pg/nL e di sgRNA a 400 pg/nL nella soluzione iniettabile; Tuttavia, questo può anche aumentare il taglio fuori bersaglio e/o diminuire la salute dell'embrione. L'efficienza di taglio può anche essere aumentata iniettando direttamente nella cella. Tuttavia, l'iniezione nel sacco vitellino è tecnicamente meno impegnativa e fornisce un taglio sufficiente per produrre pesci con un'elevata trasmissione germinale (>70% della prole contenente un allele modificato).
13. Rimetti gli embrioni iniettati in una capsula di Petri adeguatamente etichettata, coprili con 1x terreno E3 con blu di metilene e mettili in un'incubatrice per embrioni impostata a 28 °C.
14. A 24 ore dalla fecondazione (hpf), ispezionare la salute degli embrioni iniettati, rimuovendo gli individui morti o con sviluppo anomalo e cambiare il terreno (vedi Figura 1). Controllare il tasso di sopravvivenza rispetto al controllo non iniettato.
    nota: Quando si prende di mira un gene non essenziale, ci si aspetta una letalità inferiore al 10% rispetto al controllo non iniettato. Se si osservano livelli elevati di letalità nelle popolazioni con iniezione guida rispetto al controllo senza iniezione, ciò può indicare che il gene bersaglio è essenziale per lo sviluppo o che gli effetti fuori bersaglio stanno portando a uno sviluppo fallito. Potrebbe essere necessario ridurre la quantità di reagenti CRISPR iniettati o potrebbe essere necessaria la generazione di un nuovo sgRNA con effetti off-target ridotti.
15. Riporta gli embrioni nell'incubatrice e continua a far crescere gli embrioni a 72 hpf, cambiando il terreno ogni giorno per mantenere la salute dell'embrione.

Risultati

Figura 1: Confronto dello stato di salute di 24 embrioni iniettati hpf. Un embrione vivente (A) sviluppato a 24 hpf, è facilmente distinguibile da un embrione che ha abortito lo sviluppo (B). Gli embrioni che assomigliano a (B) o hanno caratteristiche drasticamente alterate rispetto a (A), come la curvatura spinale o lo sviluppo alterato della testa e degli occhi, devono essere rimossi dal piatto

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acqua priva di RNasi	Qualsiasi marca		Sintesi di RNA guida. Thermo Fisher e Qiagen portano entrambi acqua adatta.
Terreno embrionale E3	Fatto in casa		Terreni per l'allevamento di embrioni e fare injeciton plate. Ricetta: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Blu di metilene	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M9140	Aggiunto a 1x terreno E3 per prevenire la crescita fungina sugli embrioni.
Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Conservare gli embrioni, piastra per iniezione fusa
agarosio	Denville	CA3510-8	Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
Stampo per microineczione	Strumenti di scienza adattiva	TU-1	Per creare pozzetti per contenere gli embrioni durante l'iniezione
Rosso fenolo	Sigma-Aldrich	P0290	Colorante per la visualizzazione dell'iniezione
olio minerale	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Per calibrare il volume di iniezione dell'ago.
Pipette di trasferimento	Qualsiasi marca		Spostamento di embrioni
lametta	Thermo Fisher	Codice 11295-10	Taglio dell'ago per iniezione, taglio della coda del pesce adulto.
incubatrice			Mantenimento degli embrioni a 28,5 C.
Estrattore per pipette a verticola	David Kopf Strumenti	700C	Generare aghi per iniezione. Istruzioni aggiuntive per l'estrazione dell'ago: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubi capillari	Strumenti Sutter	BF100-58-10	Generare aghi per iniezione.
Punte per microloader	Eppendorf	930001007	Caricare la soluzione negli aghi per iniezione
Microiniettore	Strumenti di precisione mondiali	PV 820	Iniezione di embrioni.
Microscopio dissezionante	Leica		Iniezione di embrioni.
microonde	Qualsiasi marca		Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
scala	Qualsiasi marca		Piastra di iniezione per fusione, gel di agarosio.
guanti	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
N2	Qualsiasi marca		Per espellere il liquido dal capillare per l'iniezione di embrioni
Provette per strisce PCR	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Puntali da 200 μl	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Puntali da 10 μl	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.
Micropipette	Qualsiasi marca		Per tutti gli aspetti del protocollo.