Xenotrapianto derivato da paziente Zebrafish (zPDX): un modello di cancro

Abstract

Fonte: Wang L. et. al., Modello eterogeneo di xenotrapianto derivato dal paziente del cancro al pancreas utilizzando larve di pesce zebra come ospiti per la valutazione comparativa dei farmaci. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la tecnica per creare un modello di xenotrapianto derivato da un paziente zebrafish. Nel protocollo campione, valutiamo l'efficacia dei farmaci Gemcitabina e Navitoclax sul modello di xenotrapianto di tumore pancreatico.

Protocollo

1. Iniezione di Sospensione Cellulare Mista nel Pesce Zebra

1. Aggiungere 10 volte la soluzione di tricaina nell'acqua E3 per anestetizzare le larve di zebrafish e trasferire le larve (dal passaggio 2.3) alla piastra di iniezione riempita con E3 modificato (E3 con 1 g/L di glucosio e 5 mmol/L di L-glutammina).
2. Riempire 25 μl di sospensione di cellule miste nell'ago dei microcapillari e inserire l'ago nel manipolatore per microiniezione.
3. Impostare la pressione e il tempo di iniezione. Iniettare 50-80 cellule (~8 nL) nel sacco vitellino del pesce zebra 48 hpf.

2. Coltura del pesce zebra xenotrapiantato (modello zPDX)

1. Trasferire le larve di zebrafish post-xenotrapianto in 40 mL di soluzione miscelata (soluzione E3 con 1 g/L di glucosio e 5 mmol/L di L-glutammina) a 32 °C.

3. Somministrazione di farmaci sul pesce zebra xenotrapiantato e valutazione della vitalità delle cellule tumorali/fibroblasti

1. Determinazione della concentrazione ottimale di gemcitabina/navitoclax.
   1. Posizionare 10 embrioni di pesce zebra wildtype a 48 hpf in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
   2. Aggiungere diverse concentrazioni di gemcitabina o navitoclax in ogni pozzetto e incubare a 32 °C per due giorni.
   3. Dopo 2 giorni, calcolare il dosaggio di tolleranza massima (MTD) di gemcitabina e navitoclax al quale le larve di zebrafish non mostrano malformazioni significative e comportamento anomalo e le concentrazioni di lavoro sono fissate al di sotto dell'MTD.
2. Trattamento di modelli zPDX con gemcitabina/navitoclax.
   1. Mettere 10 larve xenotrapiantate in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
   2. Dividere le larve in quattro gruppi, trattare il gruppo di controllo in E3 contenente lo 0,1% di DMSO e trattare gli altri gruppi con 5 μg/mL di gemcitabina e/o 50 μM di navitoclax e incubare a 32 °C per due giorni.
3. Valutazione della vitalità cellulare e della composizione cellulare in modelli zPDX.
   1. Anestetizzare le larve xenotrapiantate dopo il trattamento e metterle in metilcellulosa al 3%.
   2. Fotografa le larve dalla vista laterale usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale.
   3. Quantifica l'intensità dei segnali di fluorescenza rossi e verdi utilizzando i software ImageJ e GraphPad.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
L-glutammina	GIBCO	21051024
Gemcitabina	Gemzan
Metilcellulosa	sigma	Codice: M0262
Navitoclax (ABT-263)	Selleck	S1001	Inibitore di Bcl-xL
attrezzatura
Microiniettore	NARISHIGE
Microscopio confocale	LEICA	SP8	0,00