Dissezione cardiaca: un metodo per osservare lo sviluppo cardiaco del pesce zebra

Abstract

Fonte: Singleman C. et. al., Dissezione cardiaca in larve, giovani e adulti di pesce zebra, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

Questo video descrive una tecnica per isolare il cuore da un pesce zebra in più fasi di sviluppo per studiare lo sviluppo cardiaco, la maturazione e l'invecchiamento.

Protocollo

1. Misurazione dei pesci e della dissezione

1. Mettere il pesce singolo nella capsula di Petri riempita a metà con PBS fresco e adagiarla sul lato destro.
2. Misurare la lunghezza del pesce dal muso alla base della coda (il peduncolo caudale), escluse le pinne caudali, utilizzando un calibro digitale in mm (Figura 1). Questa è la lunghezza standard (SL).
3. A ciascun pesce può essere assegnata una combinazione di numeri/lettere per consentire di tracciare un singolo pesce e il cuore sezionato risultante per un'analisi successiva. I dati, tra cui il numero di stock parentale, l'età al momento della fissazione, le misure SL, sono stati inseriti in un foglio di calcolo e organizzati in base a queste etichette.
4. Prima della dissezione, etichettare le strisce di provette PCR con il numero di tracciabilità assegnato e riempirle con PBT o altra soluzione appropriata per ulteriori analisi.
5. Orientare il pesce con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella capsula di Petri mentre si stabilizza il corpo con una pinza che tiene la testa tra gli occhi e le branchie (Figura 1).

Pesci più piccoli (più piccoli di 12mm SL):

6. a) Usando una pinza affilata, o un micro-ago in un portaspilli, rimuovi i muscoli pettorali e le pinne dal corpo per rivelare il cuore. Il movimento costante della pinza durante la dissezione può causare correnti nel PBT che spostano il pesce. Questo è particolarmente problematico per i pesci più piccoli, quindi un micro-ago può essere utilizzato per rimuovere i muscoli pettorali e le pinne e aprire la cavità del corpo.
7. a) Utilizzare delicatamente la pinza per estrarre il cuore dalla cavità da sotto l'atrio. In alternativa, in alcuni pesci potresti essere in grado di rimuovere il cuore tirando delicatamente fuori il bulbo e il resto del cuore seguirà. Fai attenzione alla posizione dell'atrio se usi questa tecnica in quanto può essere facilmente danneggiato. Se c'è del tessuto in più che viene fornito con il cuore, va bene e può essere eliminato dopo.
8. a) Se il pesce contiene un marcatore cardiaco fluorescente come Tg(myl7:GFP)^twu34, utilizzare un cannocchiale fluorescente per la dissezione e verificare la rimozione del cuore mediante florescenza (Figura 2).
9. a) Una volta rimosso il cuore dalla cavità, utilizzare la pinza per tenere il cuore e un micro-ago per rimuovere il tessuto non cardiaco in eccesso e il rivestimento epicardico dall'esterno del cuore.

Pesci più grandi (superiori a 12mm SL):

6. b) Utilizzando le micro-forbici con manico a molla, fai tre incisioni profonde meno di 1 mm: 1- taglio trasversale attraverso le branchie 2- taglio trasversale sul ventre anteriore 3- taglio sagittale sul lato ventrale che collega entrambi i tagli (Figura 3).
7. b) Utilizzando una pinza affilata, rimuovere i muscoli pettorali e le pinne dal corpo per aprire la cavità corporea e rivelare il tessuto argenteo del pericardio (Figura 4A). Rimuovete questo tessuto pericardico e il cuore diventerà visibile (Figura 4B).
8. b) Utilizzare le microforbici per tagliare l'arteria collegata all'arterioso bulboso, situato superiormente al cuore. Una volta che questa arteria è stata tagliata, metti le punte delle pinze sotto l'atrio, usa le pinze per estrarre il cuore dalla cavità. Se c'è del tessuto in più che viene fornito con il cuore, va bene e può essere rimosso in seguito.
9. b) Una volta che il cuore è stato rimosso dalla cavità, utilizzare le due pinze per tenere il cuore e rimuovere il tessuto in eccesso, o un paio di pinze per tenere il cuore e un micro-ago per rimuovere il tessuto in eccesso, non cardiaco. Il rivestimento epicardico, evidente dalla sua pigmentazione nera, può essere rimosso dall'esterno del cuore se lo si desidera raschiando delicatamente il tessuto.

Risultati

Figura 1.Tieni il pesce con una pinza tra gli occhi e le branchie.

Figura 2.Un marcatore transgenico fluorescente specifico per il cuore come Tg(myl7:GFP)^twu34, mostrato qui, può aiutare a visualizzare i cuori sezionati da pesci più piccoli.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze #55	Strumenti per la scienza	Codice: 11295-51
Micro-forbici	Strumenti per la scienza	Codice: 15005-08
Porta spilli	Strumenti per la scienza	Codice 26016-12
Micro-aghi	Strumenti per la scienza	Codice 10130-10
Piastre di Petri	BD Bioscienze	351029