Dissezione cerebrale del pesce zebra: una tecnica di neurobiologia dei pesci

Abstract

Fonte: Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolamento e coltura delle neurosfere derivate dal cervello del pesce zebra adulto. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive la tecnica di microdissezione del cervello da un pesce zebra adulto. Questo metodo aiuta a ottenere neuorosfere derivate dall'intero cervello che possono essere studiate ulteriormente.

Protocollo

1. Dissezione del cervello adulto del pesce zebra

1. Preparare un letto di dissezione riempiendo una piastra di Petri da 100 mm x 15 mm con impacchi di ghiaccio in gel. Quindi posizionare il coperchio sulla capsula di Petri e incubare a -20 °C fino a quando il gel non si congela. Sopra il coperchio posizionare un quadrato di carta da filtro pulita e avvolgere sia la carta da filtro che la capsula di Petri con una pellicola di plastica.
2. Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti di microdissezione con etanolo al 70% o calore prima di ogni utilizzo. Posizionare tutti gli strumenti di dissezione sterilizzati vicino al microscopio da dissezione e, subito prima dell'eutanasia, posizionare il letto di dissezione sotto il microscopio con illuminazione a fibre ottiche.
3. Raccogli 2 pesci zebra adulti per una preparazione di neurosfere dell'intero cervello; e da 3 a 4 pesci zebra per generare neurosfere da regioni cerebrali sezionate.
4. Eutanasia del pesce zebra adulto (8-12 mesi) utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. Successivamente, immergere il pesce in etanolo al 75% per 5-10 secondi e posizionarlo rapidamente nel letto di dissezione seguito dalla decapitazione a livello delle branchie utilizzando una lama chirurgica.
   1. Per l'eutanasia degli animali, somministrare un sovradosaggio (300 mg/L) di tricaina metansulfonato fino a quando il battito cardiaco dell'animale non rallenta gradualmente e la circolazione si ferma, quindi immergere in acqua ghiacciata.
5. Girare la testa con il lato dorsale verso il basso e usando le forbici fare un taglio longitudinale dal lato tagliato alla bocca. Usando la pinza esponi la base del cranio e rimuovi tutto il tessuto adiacente. Taglia le pareti laterali del cranio dall'inizio del midollo spinale verso il tectum.
6. Usando le forbici, tagliare e rimuovere i nervi ottici e quindi rimuovere entrambi i lati della parte più laterale del cranio a livello del tetto. Girare la testa con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Usando una pinza, stacca il resto della parte più apicale del cranio.
7. Trasferire il cervello insieme alla parte rimanente del cranio in un nuovo piatto con il mezzo di dissezione (DMEM/F12 con penicillina/streptomicina). Pulisci il tessuto cerebrale nel mezzo di dissezione usando il manico in plastica del micro coltello, mantenendo intatte tutte le strutture cerebrali.
8. Da questo punto, continuate il protocollo utilizzando l'intero cervello del pesce zebra.
   1. In alternativa, adattare questo protocollo a specifiche regioni cerebrali per generare neurosfere dall'intero cervello di zebrafish o dal telencefalo, dal tectum/diencefalo o dal cervelletto sezionato con un bisturi fresco. Utilizzare una linea neurale transgenica fluorescente neurale specifica per sezionare la regione cerebrale di interesse secondo la Figura 1.

Risultati

Figura 1: Differenziazione delle neurosfere derivate dal cervello del pesce zebra.(A-C, E) Immagini a contrasto di fase di neurosfere derivate da tutto il cervello coltivate nel mezzo di differenziazione Z durante 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) e 4 (C e D, DiVd4) giorni. (E) Vista dorsale de...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12 1x	Tecnologie per la vita	Codice 11330-032
Penicillina-streptomicina	Tecnologie per la vita	Codice: 15140-122
Tricaina MS-222	sigma	Codice: A5040	soluzione madre da 4 mg/ml