Iniezione ortotopica: impianto di cellule tumorali tessuto-specifiche in un topo adulto

Abstract

Fonte: Katsuta, E., et al. Generazione di un modello di carcinoma mammario metastatico ortotopico murino ed esecuzione di mastectomia radicale murina.J. Vis. Exp.(2018).

Il video dimostra la tecnica di inoculazione ortotopica del cancro al seno in un modello murino. Questa tecnica produce un alto tasso di tumorigenesi con una minore variabilità nelle dimensioni e nella forma del tumore rispetto all'iniezione sottocutanea o non chirurgica.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule (per 10 topi)

NOTA: Le cellule devono essere inoculate entro 1 ora dopo essere state staccate dalla capsula per evitare una diminuzione della vitalità cellulare. In particolare, la sospensione cellulare deve essere miscelata nella miscela proteica gelatinosa entro 15 minuti dal distacco delle cellule dalla piastra per mantenerne la vitalità.

1. Coltura di cellule 4T1-luc2, una linea cellulare di adenocarcinoma mammario di topo che esprime luciferasi, in terreno RPMI 1640 con il 10% di FBS in un incubatore umidificato a 37 °C in CO_{2 al} 5%.
2. Lavare le cellule aderenti 4T1-luc2 in un piatto di 10 cm con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% utilizzando una pipetta P1000 e, quindi, incubare il campione a 37 °C per 5 minuti. Quindi, aggiungere 4 mL di terreno di coltura (RPMI-1640 con il 10% di FBS) utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL in una cappa di coltura tissutale. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 5 min.
3. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di PBS; quindi, contare le cellule utilizzando l'emocitometro.
4. Sospendere 2 x 10⁶ cellule 4T1-luc2 in 40 μL di PBS freddo (pH 7,4, 4 °C) nella cappa di coltura tissutale.
5. Miscelare la sospensione cellulare da 40 μl con 360 μl di miscela proteica gelatinosa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio nella cappa di coltura tissutale.
   NOTA: La concentrazione finale è 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS: miscela di proteine gelatinose). Per il modello ortotopico (senza mastectomia), è stato utilizzato 1 x 10⁴/20 μL della concentrazione finale, per evitare di raggiungere i criteri di eutanasia (dimensione del tumore > 2 cm) entro due settimane.

2. Inoculazione delle cellule tumorali

1. Mettere i topi nella camera di induzione dell'anestesia con isoflurano al 2-4% e flusso di ossigeno di 0,2 L/min fino a quando i topi respirano tranquillamente (2-3 min).
2. Afferrare il topo e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina nella spalla per via sottocutanea.
3. Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione a un pizzicamento del dito del piede. Inserire il naso del topo nel foro della maschera per topi, che consente l'anestesia inalatoria con isoflurano al 2-4% e flusso di ossigeno di 2 L/min collegato a un'unità di bomboletta di carbone.
4. Trattenere gli arti del topo con del nastro adesivo da laboratorio e sterilizzare la sua pelle con clorexidina, iodio ed etanolo al 75%, utilizzando tamponi di cotone.
5. Praticare un'incisione cutanea di 5 mm al centro della parete toracica anteriore utilizzando le forbici sterili per microdissezione, sollevare la pelle sul lato destro accanto all'incisione e staccare la pelle dalla parete toracica usando le forbici, quindi invertire la pelle per esporre il cuscinetto adiposo mammario #2 destro.
6. Iniettare con cautela 20 μL di sospensione di cellule tumorali utilizzando una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 28,5 G nel cuscinetto adiposo sotto visione diretta attraverso la ferita.
   NOTA: L'ago passa attraverso la ferita, non la pelle. Continua a tenere l'ago nel cuscinetto adiposo per 5 secondi prima di estrarlo, il che lascia il tempo alla miscela proteica gelatinosa di solidificarsi.
7. Chiudere le incisioni cutanee mediante sutura, utilizzando suture sterili 5-0 non assorbibili.
8. Dopo l'intervento chirurgico, riportare gli animali in una gabbia pulita e monitorarli fino a quando non si sono ripresi e si muovono liberamente (dopo ~1-2 minuti). Se un animale non sembra essere in buona salute entro 24 ore dall'intervento, somministrare buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Rimuovere i punti di sutura in anestesia (vedere passaggio 2.1) 7 giorni dopo l'intervento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Forbici per micro dissezione	Roboz	RS-5983	Per l'inoculazione delle cellule tumorali e la mastectomia
5-0 suture di seta	guardare	774B F
Istituto commemorativo di Roswell Park 1640	Gibco	11875093	Per coltura cellulare
Siero fetale bovino	Gibco	10437028	Per coltura cellulare
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Per coltura cellulare
Sterilizzante a secco (Germinator 500)	Braintree Scientifico	GER 5287-120V	Per l'inoculazione delle cellule tumorali e la mastectomia
Porta aghi	Roboz	RS-7830	Per l'inoculazione delle cellule tumorali e la mastectomia
Pinza Adson	Roboz	RS-5233	Per l'inoculazione delle cellule tumorali e la mastectomia
Clipper	Wahl	9908-717	Per l'inoculazione delle cellule tumorali e la mastectomia
Matrigel	Corning	354234	Per l'inoculazione delle cellule tumorali