Co-coltura 3D con interazione diretta: co-coltura di cellule tumorali con monociti per studiarne l'interazione

Abstract

Fonte: Espinoza-Sánchez, et al. Analisi della comunicazione tra monociti e cellule primarie di cancro al seno in un sistema tridimensionale basato su estratto di matrice extracellulare (ECME). (2018).

Questo video descrive la co-coltura 3D di cellule di cancro al seno con monociti per studiare la loro interazione in un ambiente basato su estratto di matrice extracellulare (ECME). Questo metodo aiuta a studiare caratteristiche specifiche come la degradazione del collagene, il reclutamento delle cellule immunitarie e l'invasione cellulare.

Protocollo

1. 3D co-culture con interazione diretta

1. Etichettare le cellule BrC e i monociti con diversi coloranti fluorescenti prima della coltura cellulare per consentire lo smistamento indipendente di ciascuna linea cellulare dopo la coltura per l'analisi dell'mRNA e dell'espressione proteica. Utilizzare derivati disponibili in commercio della cumarina e della rodamina che passano liberamente attraverso la membrana cellulare delle cellule viventi. Un protocollo generale per l'etichettatura è il seguente:
   1. Preparare un monostrato di cellule BrC di interesse (2 × 10⁶ cellule in un pallone di coltura da 25 cm²) e sostituire il terreno standard con una quantità sufficiente di soluzione di lavoro preriscaldata del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente in terreno di base standard senza alcun supplemento). Incubare 30 minuti a 37 °C in un ambiente umidificato con CO₂ al 5%. Aspirare la soluzione colorante e risciacquare delicatamente con una quantità sufficiente di 1x PBS. Aspirare il PBS e aggiungere il terreno standard.
   2. Tripsinizzare il monostrato cellulare con 2 mL di una soluzione di tripsina allo 0,05% e 0,48 mM di EDTA per 5-10 minuti a 37 °C. Aggiungere 200 μL di FBS per arrestare la tripsinizzazione e 7 mL del terreno corrispondente senza integratori. Risospendere le cellule mediante pipettaggio. Prelevare un'aliquota di 10 μl per contare le cellule in una camera di Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle cellule.
   3. Pellettare le cellule a 430 x g per 5 minuti a RT (eseguire questa operazione per prima poiché i monociti crescono in sospensione). Scartare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con 3 mL di una soluzione di lavoro preriscaldata del colorante fluorescente (1:2.000 del colorante fluorescente in un terreno di base standard senza integratori). Incubare per 30 minuti a 37 °C in un ambiente umidificato con CO₂ al 5%.
   4. Pellettare nuovamente le cellule, scartare la soluzione di lavoro del colorante e risospendere delicatamente con 5-7 mL di 1x PBS. Pellettare ancora una volta, scartare il PBS e risospendere le cellule in 5-7 mL di terreno standard. Prelevare un'aliquota di 10 μl di sospensione cellulare per contare le cellule in una camera di Neubauer. Continuare con il protocollo di co-coltura dopo il conteggio delle cellule.
2. Impostare la co-coltura come segue: stendere una quantità sufficiente di ECME sul fondo del pozzetto per formare uno strato uniforme in ciascun pozzetto di un sistema di vetrini a camera a 4 pozzetti. Piastra da 20 μl di una sospensione a cellula singola contenente 5 × 10⁵ cellule BrC marcate per pozzetto.
3. Dopo 15-20 minuti di incubazione a 37 °C, aggiungere una sospensione di 2,5 x 10⁵ monociti marcati in terreno di prova da 80 μL (integrato con ECME al 60%).
4. Lasciare solidificare l'ECME per 15-20 minuti a 37 °C.
5. Aggiungere 1 mL di una miscela 1:1 di cellule BrC e terreni di coltura per monociti.
6. Incubare le co-colture a 37 °C in un ambiente umidificato con CO₂ al 5% per 24 ore, 48 ore o 5 giorni per tenere traccia dei cambiamenti in diversi punti temporali.
7. Degradare le proteine della ECM per recuperare le cellule dalle colture. Aspirare ed eliminare il terreno, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con 0,1% di tripsina e 0,25% di EDTA e incubare per 3 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 mL di 1x PBS con il 10% di FBS per neutralizzare la tripsina e risospendere le cellule pipettando energicamente per ottenere una sospensione a cellula singola.
8. Pellettare le celle a 765 x g per 5 minuti a RT, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di 1x PBS con il 10% di FBS. Ripetere questo passaggio una volta.
9. Sottoporre la sospensione cellulare a smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) con lo strumento appropriato. Assicurarsi che le popolazioni finali siano pure almeno al 95%).
10. Dopo la cernita, lavare le cellule con 1x PBS sterile, pellet (430 x g per 5 minuti a RT) e risospendere in 1x PBS sterile. Le cellule possono essere processate secondo protocolli specifici per l'isolamento dell'RNA o l'analisi delle proteine.
11. Ripetere ogni test tre volte, includendo come controlli le colture 3D di ogni singola linea cellulare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
U937	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	Codice CRL-1593.2	Linea cellulare monocitica/linfoma istiocitico
THP-1	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	TIB-202	Linea cellulare monocitica/leucemia monocitica acuta
MCF-10A	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	Codice CRL-10317	Linea cellulare mammaria non trasformata
MCF-7	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	HTB-22	Linea cellulare per cancro al seno
MDA-MB-231	Collezione di cultura di tipo americano ATCC	HTB-26	Linea cellulare per cancro al seno
RPMI 1640 medio	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice 11875-093
DMEM/F12	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice 11039-021
Antibiotico/Antimicotico	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice 15240-062	100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 0,25 μg/mL di Fungizone
Siero fetale bovino	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice 16000-044
Siero per cavalli	Tecnologie GIBCO BRL Life	16050114
0,05% tripsina-EDTA 1X	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice 25300-062
PBS 1X (soluzione salina tamponata con fosfato	Tecnologie GIBCO BRL Life	Codice: 20012-027
Fattore di crescita epidermico (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1,00 mg)
insulina	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
idrocortisone	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Tossina del colera Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), estratto di matrice extracellulare, Conservare a -20°C fino all'uso a 4°C
Vetrino per camera Lab-Tek con coperchio (8 pozzetti)	Nalge Nunc International	177402