zPDX-Analisi dell'invasività: studio del comportamento invasivo delle cellule tumorali metastatiche negli xenotrapianti di embrioni di zebrafish

1. Immagine e analisi del processo metastatico

1. Raccogli diversi embrioni anestetizzati con una pipetta Pasteur a punta larga e trasferiscili sul fondo di vetro di una capsula di polistirolo.
2. Eliminate l'acqua in eccesso e conservate una quantità limitata di acqua d'uovo. Manipola l'embrione in posizione con uno strumento ad anello per capelli e posiziona un coperchio sopra il vetro.
3. Utilizzare un microscopio confocale invertito in combinazione con obiettivi a immersione in acqua o a secco a lunga distanza. Posizionare l'embrione in modo che la regione di interesse sia il più vicino possibile all'obiettivo.
4. Eseguire l'imaging immediatamente dopo l'anestesia per ridurre il rischio di morte dovuta all'evaporazione del liquido.
   1. Cattura i segnali dalla vascolarizzazione marcata con EGFP e dalle cellule tumorali marcate con mCherry nella stessa posizione sugli embrioni per co-registrare le cellule iniettate con i vasi sanguigni fondendo i due canali di imaging.
   2. Per ogni embrione di zebrafish, raccogli due diversi set di immagini dalla regione della testa e dalla regione della coda.
5. Quantificare il numero di cellule disseminate.
   1. Per le iniezioni nello spazio perivitellino, contare il numero di cellule in ciascun pesce che si sono disseminate dalla massa cellulare verso il corpo embrionale del pesce all'interno delle regioni della testa e della coda 4,15; le regioni sono oltre i confini della cavità cardiaca frontalmente, sopra la vescica natatoria dorsalmente e oltre l'apertura urogenitale caudalmente.
   2. Per l'iniezione di Doc, contare il numero di singole cellule che hanno invaso le fibre di collagene della pinna caudale dalla circolazione (MDA-MB-231) o il numero di cluster formati da cellule collettivamente (M2) nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) di ciascun zebrafish19.
6. Studia l'invasione e le metastasi in modo più dettagliato utilizzando la microscopia confocale (altamente raccomandata).
   1. Utilizzare un basso ingrandimento (obiettivo 4X) per visualizzare l'intero corpo e ottenere una panoramica del modello di disseminazione delle cellule tumorali.
      NOTA: L'ingrandimento maggiore (obiettivi 20X e 40X) è adatto per studiare l'angiogenesi intra e peri-tumorale e la localizzazione precisa delle cellule disseminate nel corpo dell'embrione.
   2. Utilizzare un laser a 488 nm per scansionare la vascolarizzazione dell'embrione di zebrafish e un laser a 543 nm per scansionare le cellule tumorali impiantate marcate con fluorescenza rossa. Ottieni un'immagine di alta qualità scansionando ogni embrione in otto-dieci passaggi. Scansiona e calcola la media di ogni passaggio sei volte.
7. Rimetti con cura l'embrione nell'acqua dell'uovo se è necessario per ulteriori esperimenti.