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1. Decellularizzazione
NOTA: Questa procedura è stata adattata da metodi precedentemente pubblicati incentrati sulla decellularizzazione adiposa, che includeva il detergente ionico desossicolato di sodio piuttosto che il dodecil solfato di sodio per rimuovere il DNA in modo efficiente.
- Il giorno 1, rimuovere i cuscinetti adiposi mammari congelati o le MFP da -80 °C e scongelare a temperatura ambiente.
- Una volta scongelato, asciugare brevemente le stampanti multifunzione con una delicata salvietta. Pesare i dispositivi multifunzione utilizzando una bilancia analitica.
- Utilizzando un paio di pinze con forbici o bisturi, dividere il tessuto in campioni di 3 mm x 3 mm x 3 mm per lo studio della ECM intatta e del tessuto rimanente per la produzione di idrogel.
nota: Il numero di campioni dipende dal numero di metodi di prova, ad esempio la raccolta di due campioni è descritta di seguito: uno per l'inclusione di paraffina (fase 1.5) e uno per il congelamento in mezzo di inclusione del criostato, se lo si desidera (vedere la tabella dei materiali e la fase 1.6).
- Pesare i fazzoletti. Se si incorpora in paraffina per il sezionamento, continuare con il passaggio 1.5. Se si congela in un mezzo di inclusione del criostato per il sezionamento, continuare con il passaggio 1.6.
- In una cappa chimica, immergere il tessuto in formalina tamponata neutra al 10% (NBF) (vedere la Tabella dei materiali) per 24 ore a 4 °C. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuna. Immergere il tessuto in saccarosio al 30% per 48 ore a 4 °C.
- Pesa il fazzoletto ora che questo pezzo è stato rimosso. Continuare con il passaggio 1.6.
- In una cappa chimica, posizionare i pezzi della MFP in una cassetta etichettata preparata con mezzo di inclusione del criostato. Aggiungere altro terreno di inclusione del criostato per coprire il tessuto.
- Collocare la cassetta in un becher di 2-metilbutano (vedere la Tabella dei materiali) pre-raffreddato con azoto liquido. Il becher dovrebbe avere abbastanza 2-metilbutano per coprire il fondo, ma non abbastanza per immergere la cassetta perché il mezzo di inclusione del criostato non dovrebbe toccare il 2-metilbutano. Lasciare riposare la cassetta nel 2-metilbutano fino a quando il mezzo di inclusione del criostato non si congela e diventa opaco.
- Avvolgere la/e cassetta/e in un foglio di alluminio, etichettare e lasciare a -80 °C fino al momento dell'utilizzo per il sezionamento.
nota: I tessuti posti immediatamente nel terreno di inclusione del criostato sono stati sezionati a 5 μm, mentre i tessuti incubati nel saccarosio sono stati sezionati a 30 μm per mantenere la morfologia degli adipociti.
- Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto rimanente.
nota: I pezzi di tessuto possono anche essere posti in NBF al 10% per 24-48 ore, risciacquati in PBS e lasciati in etanolo al 70% fino all'inclusione in paraffina. Dopo l'inclusione, le sezioni da 5 μm possono essere utilizzate per la colorazione con ematossilina ed eosina (H ed E) (vedere la sezione 2 di seguito).
- Posizionare le stampanti multifunzione in piatti da 6 cm con 5 mL di soluzione di tripsina allo 0,02% e EDTA allo 0,05%. Incubare a 37 °C per 1 ora. Spruzzare e pulire le stoviglie con etanolo al 70% prima di metterle nell'incubatrice.
- Utilizzare filtri da 0,7 mm per lavare le stampanti multifunzione con acqua deionizzata (DI) versando acqua sul fazzoletto tre volte. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare. Posizionare i fazzoletti in un becher pre-autoclavato contenente un'ancoretta di dimensioni adeguate. Coprire i fazzoletti con 60 mL di t-ottilfenossipolietossietanolo al 3% (vedere la Tabella dei materiali) per 1 g di fazzoletto e agitare per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 ml.
- Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino. Sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui fazzoletti. Ripeti altre due volte. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare. Riposizionare i fazzoletti e le barrette negli stessi becher e coprire con 60 ml di acido desossicolico al 4% per 1 g di tessuto. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 ml.
- Versare il tessuto e il contenuto in un colino a rete. Sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui fazzoletti. Ripeti altre due volte. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare.
- Mettere i fazzoletti nello stesso becher con acqua fresca per via endovenosa integrata con penicillina-streptomicina all'1%. Coprire bene con pellicola di paraffina. Lasciare agire per una notte a 4 °C.
- Lavare i filtri e i becher per utilizzarli il giorno successivo.
- Il giorno 2, scolare il contenuto del bicchiere in un colino. Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare.
- Posizionare le stampanti multifunzione nello stesso bicchiere con un'ancoretta di dimensioni adeguate. Coprire con 60 mL di soluzione di etanolo al 4%/acido peracetico allo 0,1% per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 ml. Mescolare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto. Rimettere il contenuto nel bicchiere. Lavare il fazzoletto coprendolo con 60 ml di 1x PBS per 1 g di fazzoletto. Utilizzare un minimo di 20 ml. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti una volta.
- Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto. Rimettere il contenuto nel bicchiere. Lavare il fazzoletto coprendolo con 60 ml di acqua deionizzata per 1 g di fazzoletto. Utilizzare un minimo di 20 ml. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti una volta.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare. Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto.
- Rimettere il contenuto nel bicchiere. Coprire i fazzoletti con 60 mL di n-propanolo al 100% per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 ml. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare. Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino da 0,7 mm. Usa una pinza per massaggiare manualmente il tessuto.
- Rimettere il contenuto nel bicchiere. Lavare il fazzoletto coprendolo con 60 ml di acqua deionizzata per 1 g di fazzoletto. Utilizzare un minimo di 20 ml. Mescolare per 15 minuti a temperatura ambiente. Ripeti tre volte.
- Versare il fazzoletto e il contenuto in un colino. Ripetere i passaggi 2.3-2.6 per raccogliere pezzi di tessuto per l'incubazione e il congelamento del saccarosio nel terreno di inclusione del criostato.
- Asciugare brevemente il fazzoletto su un'attività delicata, strofinare e pesare. Mettere in una provetta da 15 ml etichettata. Congelare a -80 °C durante la notte.