Aumento della dose: un metodo per sviluppare la resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Yamaoka T. et al., Istituzione e caratterizzazione di tre linee cellulari di adenocarcinoma polmonare PC-9 resistenti ad Afatinib sviluppate con dosi crescenti di Afatinib. J. Vis. Exp., 2019

Il video descrive lo sviluppo della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali esponendo le cellule a dosi crescenti di un farmaco dopo aver calcolato i valori IC₅₀ del farmaco precedentemente con il test MTT. Il protocollo di esempio descrive il processo passo dopo passo di sviluppo di cellule resistenti ai farmaci.

Protocollo

1. Istituzione di tre linee cellulari PC-9 indipendenti resistenti all'afatinib

1. Determinazione della concentrazione iniziale di esposizione ad afatinib per le cellule PC-9 utilizzando il test 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).
   1. Coltura di cellule PC-9 in terreno di crescita contenente siero fetale bovino (10%), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL) in un piatto di 10 cm trattato con coltura cellulare in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C.
   2. Risospendere le cellule PC-9 a 4 x 10⁴ cellule/mL in terreno di crescita e quindi seminare a 50 μL/pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. La concentrazione finale delle cellule è 2,0 x 10³ celle/50 μL/pozzetto. Incubare per una notte in un incubatore al 5% di CO₂ a 37°C.
   3. Aggiungere 50 μL di soluzione di afatinib a diverse concentrazioni: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 e 20 μM nei pozzetti contenenti il terreno di crescita (50 μL). Il volume finale e le concentrazioni di afatinib sono rispettivamente 100 μl e 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 μM.
   4. Incubare la piastra a 96 pozzetti per 96 ore in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C.
   5. Aggiungere 15 μL della soluzione colorante (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto e incubare per 4 ore in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C, quindi aggiungere 100 μL di solubilizzazione/soluzione di arresto (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto e incubare per una notte in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C.
   6. Misurare la densità ottica a 570 nm (OD₅₇₀) utilizzando un lettore di micropiastre (vedere la tabella dei materiali). Prepara 6-12 repliche e ripeti gli esperimenti almeno tre volte.
   7. Utilizzare un software statistico (vedi Tabella dei materiali) per tracciare graficamente questi dati come un grafico semi-logaritmico e calcolare il valore IC₅₀, che è la concentrazione di farmaco che riduce la risposta al 50% del suo massimo (vedi Tabella dei materiali).
2. Esposizione continua di cellule PC-9 all'EGFR-TKI irreversibile, afatinib, mediante aumento graduale della dose in tre piastre indipendenti da 10 cm
   1. Coltura di cellule PC-9 in piastre p100 contenenti 10 mL di terreno di crescita. Quando le cellule PC-9 raggiungono lo stadio sub-confluente, trasferire 1 mL di sospensione cellulare in tre nuove piastre p100, con 9 mL di terreno di crescita. Le cellule PC-9 diluite 1:10 diventano sub-confluenti in 3-4 giorni, con un numero di cellule di circa 4-5 x 10⁵ cellule/mL.
   2. Il giorno successivo, aggiungere 1/10 del valore IC₅₀ di afatinib in ciascuna delle tre piastre p100.
      NOTA: Afatinib viene ricostituito in DMSO a concentrazioni stock di 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM e 5 mM. Da 1 a 10 μL di soluzione di afatinib vengono aggiunti a 10 mL di terreno di crescita nella coltura, secondo le concentrazioni finali richieste.
   3. Quando le cellule nelle piastre p100 contenenti afatinib diventano sub-confluenti, mescolare bene per aspirazione con una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a 9 mL di terreno di crescita fresco in una nuova piastra p100. Successivamente, aggiungere concentrazioni superiori del 10-20% di afatinib alla nuova coltura.
   4. Aumentare la concentrazione di afatinib da 0,1 nM a 1 μM nel terreno aumentando gradualmente la dose con la concentrazione di afatinib aumentata del 10-20% ad ogni passaggio nel periodo di 10-12 mesi.
      nota: Quando la concentrazione di afatinib si avvicina al valore IC₅₀, la crescita cellulare diventa piuttosto lenta. Se le cellule vengono divise 1:9, potrebbero non crescere, poiché queste cellule vengono uccise da concentrazioni più elevate di afatinib. Pertanto, a concentrazioni più elevate di afanitib, le cellule possono essere divise con un rapporto di 1:2. Le cellule più resistenti sono state coltivate in terreno contenuto in afatinib per 3-14 giorni e il terreno non è stato cambiato fino a quando non è stato necessario far passare le cellule resistenti.
   5. Coltura delle cellule resistenti all'afatinib per 2-3 mesi in un terreno di crescita contenente afatinib da 1 μM. A una concentrazione di afatinib di 1 μM, in questo modello sono necessari 10-12 mesi per sviluppare resistenza ad afatinib. Eseguire il test MTT per confermare che le cellule sono resistenti ad afatinib. Le tre linee cellulari di resistenza ad afatinib stabilite in modo indipendente sono state denominate AFR1, AFR2 e AFR3.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
FBS	Gibco	Codice 26140-079
Penna Streptococco	Gibco	Codice: 15140-163
piatto da 10 cm trattato con coltura cellulare	Violamo	2-8590-03
afatinib	Selleck	Episodio 1011
Micropiastra a 96 pozzetti	termo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	Saggio di proliferazione cellulare non radioattiva; Soluzione colorante e soluzione di solubilizzazione/arresto
Spettrofotometro NanoDrop Lite	termo	Na	spettrofotometro
Software GraphPad Prism v.7	GraphPad, Inc.	Na	un software statistico
Dmso	Wako	Codice 043-07216