1. Preparazione di campioni di tessuto tumorale
- Fissare il tessuto tumorale in formalina tamponata neutra (NBF) al 10% in una cassetta.
nota: Il tessuto tumorale dei tumori polmonari prossimali è generalmente ottenuto mediante broncoscopia, eseguita in sedazione moderata da uno pneumologo o da uno specialista polmonare. Per le lesioni periferiche e la malattia polmonare diffusa, è indicata una biopsia transbronchiale o con ago. Queste procedure vengono solitamente eseguite in una sala operatoria o in un'unità di terapia intensiva.
- Incorporare la cassetta in paraffin.
nota: La fissazione può essere ottenuta per perfusione o immersione immediatamente dopo la dissezione e richiede in genere 8-10 ore. Il volume di fissazione deve essere 15-20 volte superiore al volume del campione. Non è consigliabile fissare il tessuto bioptico per più di 10 ore, perché l'iperfissazione può causare il mascheramento dell'antigene. La velocità di fissazione è di circa 1 mm/h a temperatura ambiente.
- Infiltrate il campione di tessuto fissato con cera nel processatore di tessuti (vedi Tabella dei materiali).
nota: La disidratazione viene eseguita in tre bagni alcolici con concentrazioni crescenti del 70%, 85% e 90%. L'acqua viene infine rimossa con tre bagni finali di alcol assoluto. La pulizia viene eseguita in tre bagni di toluene e l'infiltrazione della cera in bagni di cera calda (44-60 °C).
- Incorporare il tessuto all'interno di uno stampo riempito di paraffina fusa (vedi Tabella dei materiali) e attendere la solidificazione.
- Sezionare il tessuto incluso in paraffina a uno spessore di 3 μm su un microtomo.
- Trasferire il nastro di paraffina su un vetrino da microscopio caricato positivamente (vedere la Tabella dei materiali).
- Asciugare il vetrino per 1 ora a 37 °C.
Nota: conservare le sezioni di tessuto a 2-8 °C (preferibile) o a temperatura ambiente fino a 25 °C per preservare l'antigenicità e colorare entro 15 giorni dal sezionamento.
2. Preparazione dei campioni citologici
- Raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante (vedi Tabella dei materiali).
nota: Per questo, viene utilizzata la tecnica standard della broncoscopia.
- Lavare la distribuzione dei bronchi da campionare. Raccogli il bucato in un contenitore pulito. Etichettare il contenitore con il nome e il cognome del paziente, la data di nascita e l'origine del campione.
- Trasferire i lavaggi bronchiali in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 2 g di polvere di DL-Ditiotreitolo (vedere la Tabella dei Materiali), agitare la provetta per 30 minuti, quindi centrifugarla a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 mL di una soluzione mucolitica (vedere Tabella dei materiali).
- Agitare il campione per 20 minuti a velocità media (livello 9) e centrifugarlo a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e depositare il pellet cellulare in provette di raccolta contenenti il 10% di NBF.
- Aggiungere 4 gocce di un reagente per la preparazione di blocchi cellulari (vedere la Tabella dei materiali) al pellet cellulare.
- Trasferire il pellet cellulare in una cassetta, fissarlo in NBF al 10% e incorporarlo in paraffina per la preparazione e il sezionamento del blocco cellulare (vedere i passaggi 1.1-1.7).
