Saggio di formazione di colonie: valutazione dell'efficacia degli agenti antitumorali sulle cellule tumorali del polmone formanti colonie

Abstract

Fonte: Lee, J. Y.et al, Valutazione preclinica della bioattività della cumarina antitumorale OT48 da parte di sferoidi, saggi di formazione di colonie e xenotrapianti di pesce zebra.J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive il test di formazione delle colonie, che aiuta a determinare la capacità delle cellule tumorali del polmone di proliferare indefinitamente e formare colonie individuali. Possiamo analizzare l'effetto di un agente antitumorale sulle cellule formanti colonie analizzando i cambiamenti nel numero e/o nelle dimensioni delle colonie risultanti.

Protocollo

1. Saggi di formazione di colonie

1. Coltura di cellule A549 a una concentrazione di 20.000 cellule/^cm2 in 15 mL di RPMI1640 terreno di coltura cellulare integrato con il 10% di FBS (siero fetale bovino) e l'1% di antibiotici in un pallone da 75^cm2 in un incubatore di CO₂ a 37 °C e il 5% di CO₂.
2. Il giorno dell'esperimento, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro. Raccogliere 50.000 cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 7 minuti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere le cellule in 100 μL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) sterile in provette da 1,5 mL.
3. Erogare 1,1 mL di terreno semisolido a base di metilcellulosa (MCBM) in provette da 15 mL con una multipipetta. Preparare un tubo per ogni condizione.
4. Aggiungere 110 μL di FBS a 1,1 mL di MCBM utilizzando una micropipetta P200.
5. Semina le cellule a 1.000 cellule/mL. Raccogliere 2,4 μL di sospensione cellulare dalla soluzione madre (50.000 cellule in 100 μL di 1x PBS) utilizzando una micropipetta P2 e aggiungere a 1,1 mL di MCBM integrato con il 10% di FBS.
6. Dopo aver aggiunto le celle, agitare le provette per 1 minuto, mantenendole verticalmente alla massima velocità per mescolare bene MCBM e cellule.
7. Aggiungere i composti in esame (OT48 da solo o in combinazione con A1210477). Preparare una provetta separata come controllo per il solvente utilizzato (qui dimetilsolfossido (DMSO)). A seconda della concentrazione dei composti e del volume aggiunto per ciascuna condizione, il controllo del solvente includerà la concentrazione più elevata di solvente utilizzata per le diluizioni del composto in esame, per valutare gli effetti avversi causati dal solvente.
8. Tubi a vortice per 1 minuto.
9. Per ogni test, aggiungere 1 mL della miscela con una micropipetta P1000 al pozzetto centrale di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti.
10. Riempire i pozzetti vuoti con 1 ml di acqua sterile o 1x PBS per stabilizzare l'umidità.
11. Incubare le piastre di coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂
12. Dopo 10 giorni di incubazione, aggiungere 200 μL di una soluzione madre MTT (metiltiazolildifenil-tetrazolio bromuro) (5 mg/mL) a ciascun pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL.
13. Incubare 10 minuti in un incubatore a 37 °C e 5% CO₂. Le colonie vitali diventeranno viola.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Visualizzazione del materiale A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	Codice: 30096	4 C°
FBS	Bioovest	S1520-500	-20 C°
Penicillina-Streptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
Pallone per coltura cellulare T75	Spl	Codice: 70075	Rt
Soluzione PBS	Clone	SH30256.02	Rt
Tubo da 1,5 ml	Extragene	Tubo-170-C	Rt
Tubo da 15 ml	Hyundai Micro	H20015	Rt
Piastra a 12 pozzetti	Spl	30012	Rt
MethoCult	Tecnologie StemCell	Codice: 4230	-20 C°
Bromuro di Tiazolile Blu Tetrazolio (MTT in polvere)	sigma	Codice: M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		Rt