Saggio sullo xenotrapianto di pesce zebra: un metodo per valutare l'efficacia antitumorale delle terapie sulla tumorigenicità nel pesce zebra in vivo

Abstract

Fonte: Lee, J. Y et al.,Valutazione preclinica della bioattività della cumarina antitumorale OT48 da parte di sferoidi, saggi di formazione di colonie e xenotrapianti di pesce zebra.J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive il test di xenotrapianto di pesce zebra per valutare la formazione del tumore in vivo e studiare l'effetto degli agenti terapeutici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Saggio di xenotrapianto di pesce zebra

NOTA: Questo approccio tecnico viene visualizzato come uno schema (Figura 1).

1. Preparazione dei reagenti madre
   1. Preparare 1 L di 30 volte la soluzione di Danieau: 1740 mM di NaCl, 21 mM di KCl, 12 mM di MgSO₄•7H2O, 18 mM di Ca(NO₃)₂ e 150 mM di HEPES. Regolare il pH del tampone a 7,6 utilizzando un pHmetro.
   2. Preparare una soluzione di tricaina all'1% (50x): sciogliere 20 mg di etil 3-amminobenzoato metanosolfonato (tricaina) in 2 ml di acqua distillata.
   3. Preparare la soluzione di rosso fenolo-PBS all'1%: aggiungere 2 μl di soluzione di sale sodico rosso fenolo a 198 μl di soluzione PBS sterilizzata in una provetta da 1,5 μl.
   4. Preparare il 3% di metilcellulosa: aggiungere 3 g di metilcellulosa a 100 ml di 1x soluzione di Danieau.
2. Produzione e incubazione delle uova di zebrafish
   1. Separare una femmina e un maschio di zebrafish in una vasca divisoria riempita con acqua di rubinetto sterilizzata ai raggi UV e filtrata a 28,5 °C al buio. Dopo 24 ore di separazione, mescolare i pesci di entrambi i sessi per iniziare l'accoppiamento. Trasferire le uova fecondate dalla vasca di accoppiamento in una capsula di Petri contenente 5 ml di soluzione fresca di Danieau.
   2. Lavare le uova tre volte con 5 ml di soluzione di Danieau. Per il lavaggio, aspirare accuratamente le uova con una pipetta e trasferirle in 5 mL di soluzione fresca. Incubare per 8 ore a 28,5 °C.
      1. Dopo 8 ore di incubazione nella soluzione di Danieau, passare alla soluzione di Danieau contenente lo 0,03% di 1-fenil-2-tiourea (PTU) per inibire la pigmentazione. Separare gli ovuli opachi (non fecondati o contenenti embrioni non sviluppati) per evitare contaminazioni.
3. Dencorionazione dell'embrione
   1. 24 ore dopo la fecondazione (HPF), decorionato Zebrafish embrioni utilizzando una pinza affilata. Incubare gli embrioni da cova nella soluzione di Danieau con 0,03% di PTU a 28,5 °C fino a 48 hpf.
4. Preparazione di cellule trattate con composto
   1. Seminare A549 cellule a 20.000 cellule/cm² in 25 cm² fiasche di coltura. Dopo 24 ore di semina, aggiungere composti (qui OT48 a 50 μM e/o A1210477 a 20 μM) per 24 ore in incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Impostare il tempo di trattamento per ogni composto per mantenere la vitalità delle cellule, ma per impegnarle verso la morte cellulare. Questo punto temporale deve essere impostato individualmente in base alla vitalità cellulare, alla morfologia e ai marcatori molecolari.
   3. 2 ore prima della fine del trattamento, colorare le cellule con 4 μM di colorante fluorescente CM-Dil a 37 °C e 5% di CO₂. Dopo 2 ore di incubazione, tripsinizzare le cellule con tripsina-EDTA allo 0,05% e diluire 106 cellule in 50 μL di soluzione di fenolo rosso-PBS prima dell'iniezione.
5. Microiniezione di cellule tumorali per la formazione di xenotrapianti
   1. Anestetizzare il pesce zebra in una soluzione di tricaina allo 0,02% per 5 minuti fino a quando non si deposita su una piastra di agar.
   2. Estrarre un capillare di vetro da 1,0 mm (diametro esterno (OD)) con un estrattore per micropipette (Impostazioni del programma: P: 300, Calore: 260, Trazione: 60, VEL: 50 e Tempo: 200). Tagliare il microcapillare con una siringa per produrre un bordo affilato. Caricare i microcapillari con 20 μL di soluzione di cellule/fenolo Red-PBS. Impostare la pressione di iniezione e il tempo di erogazione di 2 nL per iniezione.
   3. Iniettare 100-200 cellule nel sacco vitellino iniettando da 6 a 10 nL tramite 3-5 iniezioni. Dopo l'iniezione, lasciare che il pesce si riprenda per 10-30 minuti in 5 ml di soluzione fresca di Danieau contenente soluzione PTU. Spedire i pesci in piastre a 24 pozzetti con 1 mL di soluzione di Danieau contenente soluzione PTU are e incubare per 72 ore a 28,5 °C.
   4. Dopo 72 ore di incubazione, anestetizzare il pesce in una soluzione di tricaina allo 0,02% e immobilizzarlo su un vetrino con una goccia di metilcellulosa al 3%. Scatta foto 5x con la microscopia a fluorescenza a una lunghezza d'onda compresa tra 620 e 750 nm.
   5. Quantifica le dimensioni dei tumori fluorescenti con il software ImageJ. Seleziona il menu "Analizza | Misura". Salvataggio dei valori corrispondenti al segnale fluorescente e analisi con un software di statistica per la rappresentazione grafica.

Risultati

Figura 1: Diagramma schematico dell'intero processo del test di xenotrapianto di pesce zebra.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Visualizzazione del materiale A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	Codice: 30096	4 C°
FBS	Bioovest	S1520-500	-20 C°
Penicillina-streptomicina	Lonza	17-602E	-20 C°
Pallone per coltura cellulare T25	Spl	Codice: 70025	Rt
Pallone per coltura cellulare T75	Spl	Codice: 70075	Rt
Pallone per coltura cellulare T175	Spl	Codice: 71175	Rt
Tubo da 1,5 ml	Extragene	Tubo-170-C	Rt
Piastra a 24 pozzetti	Spl	Telefono 30024	Rt
Petridish	Spl	Codice: 10100	Rt
Soluzione PBS	Clone	SH30256.02	Rt
Tripsina-EDTA	Gibco	Codice 25-300-054	4 C°
cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	Codice 71382	Rt
Cloruro di potassio (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	Rt
Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M2773	Rt
Nitrato di calcio tetraidrato (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1396	Rt
Soluzione HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Rt
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato (Tricaina)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Soluzione di rosso fenolo	Sigma-Aldrich	P0290	Rt
Metilcellulosa	Sigma-Aldrich	Codice: M0512	Rt
1-fenil-2-tiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Rt
Colorante CM-Dil	Invitrogen	C7001	-20 C°
Capillare in vetro	Strumenti di precisione mondiali	TW 100F-4	Rt
Estrattore per micropipette	Strumento otturatore, USA	P-97	Rt
Micro iniettore	Strumenti di precisione mondiali	Visualizzazione PV820	Rt
siringa	KOVAX	1 ml	Rt
Micro caricatore	Eppendorf	5242956003	Rt
Scivolo in vetro	Marienfeld	HSU-1000612	Rt
Microscopia a fluorescenza	Leica	DE/DM 5000B	Rt