1. Sintesi di acido ialuronico-ceramide (HACE)
- Solubilizzare 12,21 mmol di oligomero di acido ialuronico (HA) e 9,77 mmol di idrossido di tetra-n-butilammonio (TBA) in 60 ml di acqua bidistillata (DDW). Mescolate per 30 min.
- Per sintetizzare il linker DS-Y30, sciogliere 8,59 mmol di ceramide DS-Y30 e 9,45 mmol di trietilammina in 25 ml di tetraidrofurano (THF). Miscelare con 8,59 mmol di cloruro di 4-clorometilbenzoile in THF. Agitare per 6 ore a 60 °C.
- Sciogliere gli 8,10 mmol sintetizzati di HA-TBA e 0,41 mmol di linker DS-Y30 in una miscela di THF e acetonitrile (4:1, v/v). Agitare per 5 ore a 40 °C.
- Rimuovere le impurità filtrando con un agente filtrante ed eliminare il solvente organico mediante evaporazione sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando una membrana per dialisi (cut-off del peso molecolare: 3,5 kDa) e liofilizzare.
2. Preparazione delle nanoparticelle
- Sciogliere 1 mg di HB e 1 mg di paclitaxel in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e miscelare con 0,5 ml di DDW mescolando a vortice per 5 minuti. Quindi, solubilizzare HACE in quella miscela mescolando a vortice per altri 5 minuti.
- Per eliminare il solvente, riscaldare a 70 °C per 4 ore sotto un leggero getto di azoto gassoso.
- Risospendere il film composto da HACE, HB e paclitaxel con 1 ml di DDW. Filtrare con un filtro a siringa (dimensione dei pori di 0,45 μm) per rimuovere i farmaci non incapsulati.
3. Fototossicità in vitro
- Assorbimento di nanoparticelle in linee cellulari di cancro del polmone
- Preparare RPMI-1640 contenente il 10% (v/v) di siero fetale bovino e l'1% (p/v) di penicillina-streptomicina.
- Seminare le cellule A549 in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti a una densità di 1 × 105 cellule/pozzetto (triplicati per ciascun gruppo). Incubare per 24 ore a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 e al 95% di aria.
- Dopo l'adesione delle cellule, rimuovere il terreno e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Sciogliere le nanoparticelle in PBS fino a una concentrazione finale di 2 μM/ml HB. Quindi, incubare le cellule con 1 ml di PBS, NP vuote, HB-NP o HB-P-NP in ciascun pozzetto per 4 ore al buio.
- Rimuovere tutta la soluzione e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS freddo. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio. Aggiungere un terreno di coltura fresco.
- Saggio di vitalità cellulare
- Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzetto). Indossare occhiali di sicurezza laser e illuminare le celle con un laser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) al buio per vari periodi di tempo: 0, 5, 10, 20, 30 e 40 sec (0, 2, 4, 8, 12 e 16 J/cm2). Quindi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
- Aspirare il terreno e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS freddo. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.
- Aggiungere 10 μl di soluzione per la misurazione della citotossicità a ciascun pozzetto. Incubare al buio per 2 ore.
- Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
