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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Sintesi di acido ialuronico-ceramide (HACE)
- Solubilizzare 12,21 mmol di oligomero di acido ialuronico (HA) e 9,77 mmol di idrossido di tetra-n-butilammonio (TBA) in 60 ml di acqua bidistillata (DDW). Mescolate per 30 min.
- Per sintetizzare il linker DS-Y30, sciogliere 8,59 mmol di ceramide DS-Y30 e 9,45 mmol di trietilammina in 25 ml di tetraidrofurano (THF). Miscelare con 8,59 mmol di cloruro di 4-clorometilbenzoile in THF. Agitare per 6 ore a 60 °C.
- Sciogliere gli 8,10 mmol sintetizzati di HA-TBA e 0,41 mmol di linker DS-Y30 in una miscela di THF e acetonitrile (4:1, v/v). Agitare per 5 ore a 40 °C.
- Rimuovere le impurità filtrando con un agente filtrante ed eliminare il solvente organico mediante evaporazione sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando una membrana per dialisi (cut-off del peso molecolare: 3,5 kDa) e liofilizzare.
2. Preparazione delle nanoparticelle
- Sciogliere 1 mg di HB e 1 mg di paclitaxel in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e miscelare con 0,5 ml di DDW mescolando a vortice per 5 minuti. Quindi, solubilizzare HACE in quella miscela mescolando a vortice per altri 5 minuti.
- Per eliminare il solvente, riscaldare a 70 °C per 4 ore sotto un leggero getto di azoto gassoso.
- Risospendere il film composto da HACE, HB e paclitaxel con 1 ml di DDW. Filtrare con un filtro a siringa (dimensione dei pori di 0,45 μm) per rimuovere i farmaci non incapsulati.
3. Efficacia antitumorale in vivo nei topi portatori di tumore
- Modello murino indotto da cancro del polmone
- Preparare 1 × 106 cellule A549 in 0,1 ml di terreno RPMI-1640; tenerlo in ghiaccio.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione i.p. di una xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confermare la corretta anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del topo. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
nota: Se non si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzato per iniziare gli esperimenti.
- Iniettare le cellule per via sottocutanea nei fianchi sinistri di topi nudi maschi BALB/C (6-7 settimane di età, 20-22 g).
- Continua a osservare i topi finché non iniziano a muoversi nella gabbia.
nota: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Mantenere i topi in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF).
- Misurare le dimensioni del tumore con i calibri ogni giorno. Calcolare il volume del tumore (mm3) come (lunghezza × larghezza2) / 2. Quando la dimensione del tumore raggiunge circa 200 mm3 di volume, iniziare l'esperimento.
- Studio sull'efficacia antitumorale
- Dividi casualmente i topi in 4 gruppi (n = 10 per ogni gruppo).
- Anestetizzare i topi con un'iniezione i.p. di una xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confermare la corretta anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del topo. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
nota: Se non si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzato per iniziare gli esperimenti.
- Sciogliere le nanoparticelle in PBS fino a una concentrazione finale di 2 mg/ml HB. Iniettare PBS, HB libero, HB-NP o HB-P-NP attraverso la vena caudale (2 mg/kg come HB) due volte nei giorni 0 e 7.
- Continua a osservare i topi finché non iniziano a muoversi nella gabbia.
nota: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Mantieni le gabbie al buio e in condizioni specifiche di SPF.
- 24 ore dopo ogni iniezione, anestetizzare i topi con un'iniezione i.p. di una xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Confermare la corretta anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del topo. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
nota: Se non si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzato per iniziare gli esperimenti.
- Posizionare il sito tumorale sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al tumore). Indossare occhiali di sicurezza laser, spegnere l'interruttore e illuminare il tumore con un laser PDT (630 nm, 400 mW/cm2) per 500 secondi (200 J/cm2) due volte nei giorni 1 e 8.
- Continua a osservare i topi finché non iniziano a muoversi nella gabbia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
- Mantenere le gabbie in condizioni SPF. Mantenere le gabbie al buio per 24 ore dopo il trattamento laser.
- Monitorare visivamente il volume del tumore e i cambiamenti nel sito del tumore ogni giorno. Misurare la dimensione del tumore con i calibri e calcolare il volume come (lunghezza ×larghezza 2) / 2 (mm3). Scatta foto dei siti tumorali ogni giorno per verificare la presenza di alterazioni della superficie tumorale dopo la PDT.
- Il giorno 16, sacrificare cinque topi per gruppo in anestesia terminale utilizzando isoflurano.
- Con pinze e forbici, tagliare la pelle esterna ed esporre i tumori. Raccoglili con cura. Fissarli in formalina al 10%, incorporarli nella paraffina e colorarli con ematossilina ed eosina (H&E) per l'analisi istologica.
- Dopo 45 giorni di monitoraggio, sacrificare i topi rimanenti in anestesia terminale con isoflurano.