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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Instillazione polmonare
- Selezionare una cannula endovenosa commerciale lunga un pollice da 20 g da utilizzare per l'intubazione.
- Modificare manualmente la punta del catetere, piegandola per generare una leggera curvatura sulla punta, come illustrato nella Figura 1.
- Anestetizzare il topo con una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (15 mg/kg) iniettata IP e confermare l'anestesia in base all'assenza di movimento riflesso. Applicare un unguento veterinario sugli occhi subito dopo l'anestesia. Immediatamente dopo l'anestesia, applicare un unguento veterinario sugli occhi e somministrare carprofene (5-10 mg/kg SQ) per l'analgesia post-chirurgica e l'instillazione.
- Posiziona il mouse supino su una piattaforma inclinata. Come mostrato nella Figura 2, un grande raccoglitore da ufficio con anelli di sutura fissati con nastro adesivo funziona perfettamente.
- Radere la parte ventrale del collo e pulire e disinfettare la zona del collo con alcol al 70%. Con i nuovi guanti senza lattice e polvere, utilizzare strumenti chirurgici disinfettati con alcol al 70%.
- Usando le forbici affilate, praticare una piccola incisione chirurgica nel collo a circa 12 mm sotto l'incisivo inferiore.
- Con una pinza tirare delicatamente la pelle del collo caudalmente fino a quando non si vede la parete ventrale della trachea.
- Ritrarre delicatamente la lingua e inserire la cannula con la punta piegata inclinata verso la superficie ventrale del topo. Come in 1.4, tirare delicatamente la pelle del collo e inserire la cannula nella trachea.
nota: Con un po' di pratica, il catetere sarà visibile muovendosi lungo la trachea. Se entra nell'esofago, non ci sarà alcun avvistamento visivo del movimento del catetere. Non vengono praticate incisioni nella trachea.
- Una volta che il catetere è visibile nella trachea del collo, farlo avanzare di circa 5 mm per essere fatto passare in modo affidabile le corde vocali, ma ancora ben al di sopra della carena.
- Prepararsi a instillare fino a 50 μl di liquido iniettando attraverso il catetere con un puntale per pipetta di caricamento in gel. Posizionare la punta nel mozzo luer, ma prima di iniettare guardare attentamente per osservare il movimento del fluido nella punta sincrono con la respirazione del topo. Quindi iniettare l'instillato.
- Con una siringa da 1 ml, gonfiare immediatamente in modo relativamente rapido 0,6 ml di aria nei polmoni attraverso il catetere per aiutare a distribuire il liquido in profondità nei polmoni. Rimuovere la cannula.
- Rimuovere la cannula.
- Utilizzare una piccola quantità di adesivo cianoacrilato per chiudere la piccola ferita chirurgica secondo le istruzioni del foglietto illustrativo di VetBond. Metti i topi in gabbie individuali e monitorali visivamente fino a quando non si svegliano e si comportano normalmente senza alcuna indicazione di disagio.
2. Misurazione del volume polmonare fisso
- Misurare il volume polmonare utilizzando il principio di Archimede, come illustrato nella Figura 3. Rimuovere il polmone fisso dalla formaldeide e sezionare il cuore e qualsiasi altro tessuto non polmonare.
- Utilizzare un semplice dispositivo di supporto a filo fatto in casa costruito in precedenza che viene utilizzato per mantenere i polmoni completamente sott'acqua.
nota: Questo dispositivo deve essere reso compatibile con qualsiasi bilancia utilizzata. Un tipico dispositivo mostrato nella Figura 4 è costituito da pipette di plastica e filo sottile (20 G). Questo sistema funziona bene con la bilancia utilizzata nel video, ma potrebbe essere facilmente adattato alla maggior parte delle bilance da laboratorio.
- Mettere un becher con ≈200 ml di acqua sulla bilancia e tarare con la gabbia di supporto in posizione nell'acqua. Vedere la Figura 5. Rimuovere la gabbia metallica; Posizionare il polmone sulla superficie dell'acqua e premere sott'acqua con la gabbia.
- Registrare il peso sulla bilancia. Questo numero riflette il volume d'acqua spostato ed è quindi una misura diretta del volume polmonare. Fare attenzione ad assicurarsi che il polmone o la sutura o qualsiasi parte della gabbia metallica non tocchino i lati o il fondo del becher.
- Per una maggiore precisione, ripetere questa misurazione. Togli il polmone dall'acqua e asciugalo su un fazzoletto. Tarare nuovamente il becher con la gabbia in posizione e ripetere la misurazione del volume polmonare. Le due misurazioni del volume devono quindi essere mediate.
nota: Se i polmoni vengono lasciati nella formalina per più di una settimana circa, l'aria nei polmoni si dissolverà nel liquido. Quando ciò accade, il polmone affonderà, quindi non è più necessario utilizzare alcun dispositivo come nella Figura 4 per mantenere il polmone sommerso. In tal caso, il volume può essere misurato semplicemente tenendo il polmone per una delle corde di sutura fino a quando non è completamente sommerso, come illustrato nella Figura 3.
