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1. Preparazione delle cellule e del terreno
- Preparare il terreno utilizzando 240 ml di Iscove's Modified Dubecco's Medium (IMDM) e 50 ml di siero fetale bovino. Non scongelare il siero fetale bovino in un bagno di acqua calda, poiché un rapido aumento della temperatura può portare a una compromissione della stabilità del siero. Combinare 240 μl di gentamicina 50 mg/ml e 5 ml di penicillina/streptomicina 100x in un pallone di coltura standard e aggiungere al terreno. Conservare il terreno a 4°C.
- Seminare le cellule U937 a ~4 x 104 cellule/ml in un pallone da 25 cm2 utilizzando il terreno preparato. Valutare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando un contatore di cellule TC20 e l'esclusione del blu di tripano inserendo 15-20 μl di cellule e 15-20 μl di blu di tripano in una provetta da microcentrifuga e mescolando il contenuto. Pipettare 15-20 μl di questa miscela in un vetrino di campionamento TC20 e iniziare i conteggi posizionando il vetrino nel contatore di cellule TC20.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e verificare la vitalità cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano e il contatore di cellule TC20. Quando le cellule hanno raggiunto una concentrazione appropriata e/o sono state trattate con sonosensibilizzatori per un periodo di tempo adeguato, trasferire 3 ml di cellule dal pallone di coltura in un flaconcino di vetro a scintillazione da 20 ml. In questo protocollo, coltivare cellule U937 per 48 ore, quindi trattare con 0,5, 1 o 5 mM di MeβCD per 30 minuti per esaurire sufficientemente il colesterolo delle cellule prima della sonicazione.
2. Sonicazione cellulare
- Degassare l'acqua distillata deionizzata utilizzando un pallone di Buchner sottovuoto. Trasferire l'acqua nel corno della tazza e riempirlo fino a un livello di 15 mm sopra la parte superiore del corno. Il processo di sonicazione provoca un ulteriore degassamento dell'acqua per un periodo di pochi minuti e può portare a incongruenze nel corso dell'esperimento se il sistema non viene eseguito prima della sonicazione del campione. Pertanto, far funzionare il sistema per ~7 minuti prima della sonicazione del campione.
- Fissare la fiala di scintillazione contenente le celle al dispositivo di fissaggio. Quindi, fissare il dispositivo di tenuta alla parte superiore del corno della tazza e regolarlo a un'altezza di 15 mm dalla parte superiore del corno (sulla superficie dell'acqua utilizzando il meccanismo di scorrimento).
- Le cellule vengono tipicamente sonicate utilizzando tre impulsi di ultrasuoni di 1 secondo, con una spaziatura di 1 secondo tra ciascuno di questi impulsi. Per questo protocollo, sonicare le celle al 33% e al 50% di ampiezza utilizzando il dosaggio a impulsi sopra menzionato.
3. Valutazione dei danni post-sonicazione delle celle
- Valutare il danno e la vitalità delle celle sospese utilizzando il blu di tripano e il contatore di celle TC20. Inoltre, analizzare il campione utilizzando un contatore Z2. Per l'analisi con contatore Z2, pipettare una sospensione cellulare da 100 μl in 20 ml di soluzione salina isotonica (rapporto 200:1). Prima dell'analisi, lavare l'apertura dell'analizzatore di particelle Z2 almeno due volte utilizzando soluzione salina isotonica. Posizionare il campione Z2 nel supporto del contatore e sollevare la piattaforma fino all'apertura prima di iniziare i conteggi.
- Acquisire i dati dai contatori TC20 e Z2 utilizzando il software fornito dal produttore. Analizza questi dati per rilevare il danno cellulare, la vitalità e la creazione di detriti cellulari dalla sonicazione.