Saggio XTT: un test colorimetrico per valutare la vitalità cellulare e l'attività mitocondriale

Abstract

Trendowski, M., et al. Generazione e analisi quantitativa degli ultrasuoni pulsati a bassa frequenza per determinare la sensibilità sonica delle cellule neoplastiche non trattate e trattate. J. Vis. Exp. (2015)

Questo articolo descrive il protocollo per il test XTT, che è un test colorimetrico per valutare la vitalità cellulare e l'attività mitocondriale.

Protocollo

1. Saggio XTT per determinare la vitalità cellulare e l'attività mitocondriale delle cellule U937 e THP1 trattate

1. Prima dei saggi XTT, coltivare le cellule U937 e THP1 nelle stesse condizioni. Pretrattare le cellule con lo stesso intervallo di concentrazione di MeβCD per 30 minuti prima della sonicazione. Utilizzare gli stessi parametri degli ultrasuoni di prima, tranne per il fatto che le celle vengono ora sonicate utilizzando un intervallo di 1-3 impulsi di un secondo distanziati di un secondo l'uno dall'altro per sviluppare un intervallo di danni che il kit XTT deve valutare.
   nota: Molti di questi passaggi sono presi direttamente dal manuale del kit XTT e vengono ripetuti solo per comodità dei laboratori interessati.
2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 10 min. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura precedentemente descritto. Risospendere le cellule a ~1 x 10⁵ cellule/ml. Seminare le cellule U937 a 100 μl per pozzetto in una piastra per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti in triplice copia, quindi ripetere per le cellule THP1 utilizzando una piastra separata a 96 pozzetti. Includere 3 pozzetti di controllo contenenti 100 μl di terreno di crescita completo da solo come letture dell'assorbanza in bianco. Quindi, incubare le piastre inoculate per 24 ore.
3. Scongelare due aliquote del reagente XTT e del reagente di attivazione a 37 °C prima dell'uso. Agitare delicatamente le aliquote fino ad ottenere soluzioni limpide. Aggiungere 0,1 ml del reagente di attivazione a 5,0 ml del reagente XTT, che forma una soluzione XTT attivata sufficiente per un saggio su piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Ripetere il processo per l'altro piatto.
4. Aggiungere 50 μl della soluzione XTT attivata in ciascun pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore di CO₂ per colture cellulari per 2 ore. Agitare delicatamente la piastra dopo il periodo di incubazione per distribuire uniformemente il colore arancione nei pozzetti positivi. Misurare l'assorbanza dei pozzetti del saggio contenenti le cellule e dei pozzetti di controllo del fondo bianco a una lunghezza d'onda compresa tra 450 e 500 nm utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione.
5. Azzerare il lettore di piastre per microtitolazione utilizzando i pozzetti di controllo in bianco o sottrarre il loro valore medio dai risultati specifici. Misurare nuovamente l'assorbanza di tutti i pozzetti del saggio a una lunghezza d'onda compresa tra 630-690 nm e sottrarre i valori dai valori di 450-500 nm ottenuti. Nota: questa seconda determinazione dell'assorbanza aiuta a eliminare le letture non specifiche dai risultati del test. Il test XTT è stato ripetuto quattro volte per entrambe le linee cellulari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Medium di Dulbecco modificato di Iscove con NaHCO3 e 25mM Hepes	Tecnologie per la vita	12440079
Disgregatore cellulare Branson SLPe 40kHz con Corno da 3" (25 mm)	Ultrasuoni Branson	Codice 101-063-726	Sonicazione dispositivo
Punta: Puntali con filtro da 100 μl e 1.000 μl	Stati Uniti d'America Scientific	1120-1840, 1126-7810
Micropipetta da 100 μl	Wheaton	851164
Micropipetta da 1000 μl	Wheaton	851168
Forma Scientific Acqua a doppia camera incubatrice incamiciata	Forma Scientifica	Telefono 3131
Kit per il saggio di proliferazione cellulare XTT	ATCC	30-1011K
Lettore di micropiastre a 96 pozzetti	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 Cellule di leucemia monocitica umana	ATCC	CRL1593.2
THP1 Cellule di leucemia monocitica umana	ATCC	TIB-202