1. Soluzioni e reagenti
- RPMI completo
- Aggiungere 56 ml di siero fetale di vitello (FCS) e 5,5 ml di 200 mM di L-glutammina a un flacone da 500 ml di terreno RPMI-1640.
- Soluzione Stock BrdU
- Preparare 32,5 mM di BrdU (10 mg/ml) in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
- BrdU RPMI completo
- Aggiungere 6,2 μl di soluzione madre di BrdU a 10 ml di Complete RPMI.
- Soluzione DNase
- Preparare 1 mg di DNasi/ml in DPBS.
- Tampone di colorazione
- Preparare FCS inattivato termicamente al 3% e sodio azide allo 0,09% in DPBS.
- Fare riferimento all'elenco dei materiali per le definizioni di tampone di fissaggio, tampone di permeabilizzazione e tampone di lavaggio.
2. Celle
NOTA: Le cellule non sono state coltivate per più di 6 mesi. Questo metodo è direttamente adattabile a qualsiasi linea cellulare non aderente con regolazioni della densità cellulare e dei terreni di coltura. Utilizzare cellule che crescono in modo esponenziale all'inizio dell'esperimento.
- Mantenere le cellule NALM6 in fiasche di coltura T-75 in RPMI completo. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili utilizzando una cappa di biosicurezza di Classe II.
- Mantenere le cellule NALM6 tra 1-2 x 10e 6 cellule per ml dividendo la coltura tre volte alla settimana.
- Incubare a 37 °C in 5% CO2 nell'aria.
3. Marcatura a impulsi di cellule con BrdU
ATTENZIONE: Maneggia BrdU con cura poiché è un potenziale mutageno e teratogeno.
- Centrifugare le celle a 150 x g per 5 min.
nota: Il trasferimento delle cellule in terreni freschi migliora la riproducibilità dei risultati.
- Eseguire un conteggio delle cellule e risospendere le cellule in RPMI completo a 2 x 106 cellule/ml.
- Diluire le cellule 1 in 2 con BrdU Complete RPMI producendo una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/ml.
- Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 45 minuti, quindi diluire le cellule 1 su 10 con RPMI completo. Centrifugare le celle a 150 x g per 5 minuti ed eliminare con cura tutto il surnatante.
- Risospendere le cellule in un piccolo volume (~100 μl) di RPMI completo, eseguire un conteggio delle cellule e regolare a 1 x 106 cellule/ml.
- Pipettare 1 ml di cellule nei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti. Pipettare 1 ml di DPBS in tutti i pozzetti non occupati per ottenere risultati più riproducibili.
- Incubare a 37 °C in 5% di CO2 nell'aria per i punti temporali desiderati, qui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 ore.
nota: La durata dipenderà da ciò che il disegno sperimentale mira a misurare.
- Trasferire tutte le cellule in provette FACS utilizzando una pipetta. Sciacquare il pozzetto in sequenza con volumi da 1 ml di PBS fino a un volume totale finale di 5 ml.
- Centrifugare a 150 x g per 5 minuti e rimuovere con cura tutto il surnatante. Le cellule sono pronte per la colorazione, eseguire questa operazione (sezione 4) immediatamente.
4. Colorazione delle celle
NOTA: Se è necessaria la colorazione superficiale delle cellule, eseguirla prima del fissaggio, assicurandoti che le celle siano mantenute a 4 °C per tutto il tempo.
- Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di colorazione (per la colorazione superficiale opzionale, aggiungere il volume raccomandato di anticorpi agli antigeni di superficie e incubare per 30 minuti a 4 °C).
- Aggiungere 1 ml di tampone colorante, centrifugare per 5 minuti a 150 x g ed eliminare il surnatante.
Nota: l'anticorpo specifico, la concentrazione, il tempo di incubazione, ecc. variano a seconda degli obiettivi sperimentali specifici.
