Colorazione in immunofluorescenza BrdU: una tecnica per identificare le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare

Abstract

Fonte: Welschinger, R., et al. Monitoraggio temporale della progressione del ciclo cellulare utilizzando la citometria a flusso senza la necessità di sincronizzazione. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video descrive il protocollo per la colorazione in immunofluorescenza BrdU. La tecnica consente l'identificazione di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare. L'aggiunta di coloranti del DNA e la marcatura degli anticorpi consentono l'analisi dettagliata del destino delle cellule della fase S in tempi successivi.

Protocollo

1. Soluzioni e reagenti

1. RPMI completo
   1. Aggiungere 56 ml di siero fetale di vitello (FCS) e 5,5 ml di 200 mM di L-glutammina a un flacone da 500 ml di terreno RPMI-1640.
2. Soluzione DNase
   1. Preparare 1 mg di DNasi/ml in DPBS.
3. Tampone di colorazione
   1. Preparare FCS inattivato termicamente al 3% e sodio azide allo 0,09% in DPBS.
4. Fare riferimento all'elenco dei materiali per le definizioni di tampone di fissaggio, tampone di permeabilizzazione e tampone di lavaggio.

2. Colorazione delle celle

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di flusso APC BrdU	BD Bioscienze	552598	Contiene anticorpo BrdU, 7-AAD e tampone BD Cytofix/Cytoperm (indicato come tampone di fissazione)
BD Perm/Wash Buffer	BD Bioscienze	554723	Denominato tampone di lavaggio
BD Pharmingen Tampone per coloranti	BD Bioscienze	554656
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
DNasi	sigma	D-4513
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Bioscienze	561651	Denominato tampone di permeabilizzazione
centrifuga	Spintron	GT-175R
Anticorpo AF488 anti-istono H3 fosfo (Ser10)	Segnalazione cellulare	9708S
Fosfo-Chk2 (Thr68) (C13C1) Corpo monoclonale di coniglio	Segnalazione cellulare	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Corpo monoclonale di coniglio	Segnalazione cellulare	2348S
Tubi FACS BD Falcon 12 x 75 mm	BD Bioscienze	352008