$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Soluzioni e reagenti
- RPMI completo
- Aggiungere 56 ml di siero fetale di vitello (FCS) e 5,5 ml di 200 mM di L-glutammina a un flacone da 500 ml di terreno RPMI-1640.
- Soluzione DNase
- Preparare 1 mg di DNasi/ml in DPBS.
- Tampone di colorazione
- Preparare FCS inattivato termicamente al 3% e sodio azide allo 0,09% in DPBS.
- Fare riferimento all'elenco dei materiali per le definizioni di tampone di fissaggio, tampone di permeabilizzazione e tampone di lavaggio.
2. Colorazione delle celle
NOTA: Se è necessaria la colorazione superficiale delle cellule, eseguirla prima del fissaggio, assicurandoti che le celle siano mantenute a 4 °C per tutto il tempo.
- Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di colorazione (per la colorazione superficiale opzionale, aggiungere il volume raccomandato di anticorpi agli antigeni di superficie e incubare per 30 minuti a 4 °C).
- Aggiungere 1 ml di tampone colorante, centrifugare per 5 minuti a 150 x g ed eliminare il surnatante.
nota: L'anticorpo specifico, la concentrazione, il tempo di incubazione, ecc. variano a seconda degli obiettivi sperimentali specifici.
- Fissazione e permeabilizzazione
- Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di fissazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare per 5 minuti a 150 x g ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di permeabilizzazione e incubare le cellule per 10 minuti su ghiaccio.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare per 5 minuti a 150 x g ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di fissazione per provetta e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare per 5 minuti a 150 x g ed eliminare il surnatante.
NOTA: Se necessario, il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fissate sono stabili per diversi giorni a 4 °C se risospese in tampone di colorazione. Rimuovere il tampone di colorazione dopo la centrifugazione prima di procedere.
- Trattamento con DNasi
- Risospendere le cellule in 100 μl di soluzione di DNasi (30 μg di DNasi/106 cellule) e incubare le cellule per 1 ora a 37 °C.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare a 150 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Colorazione degli anticorpi
NOTA: La colorazione per marcatori intracellulari diversi da BrdU può essere eseguita contemporaneamente alla colorazione BrdU.
- IMPORTANTE: Predisporre controlli di compensazione costituiti da cellule non colorate e cellule marcate con ogni singolo fluorocromo. Idealmente, per i controlli di compensazione, utilizzare gli stessi anticorpi utilizzati nelle provette sperimentali. Tuttavia, se ciò non è fattibile, sostituire gli anticorpi contro antigeni altamente espressi coniugati allo stesso fluorocromo.
- Risospendere le cellule in 50 μl di tampone di lavaggio e aggiungere 1 μl/106 cellule di anticorpo BrdU.
NOTA: Possono essere aggiunti anche anticorpi coniugati direttamente ad altri antigeni intracellulari specifici.
nota: Gli anticorpi contro l'istone H3 fosforilato su Ser10 possono essere utilizzati per discriminare tra le cellule in G2 e M, l'istone H3 è fosforilato su Ser10 durante la mitosi. Gli anticorpi contro cdc2 fosforilato su Tyr15 possono essere utilizzati per rilevare le cellule che si sono impegnate nella mitosi.
- Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio, centrifugare le celle a 150 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Colorazione del DNA per l'analisi del ciclo cellulare
- Allentare il pellet e aggiungere 20 μl della soluzione di 7-AAD (0,25 μg).
NOTA: È fondamentale utilizzare una quantità costante di 7-AAD/cellula.
- Risospendere le cellule in 1 ml di tampone di colorazione.