Co-coltura 2D di cellule leucemiche con BMSC: un metodo per ottenere sottopopolazioni di cellule leucemiche

Abstract

Fonte: Slone, W. L. et al. Modellazione della leucemia resistente alla chemioterapia in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive la tecnica per la co-coltura 2D a lungo termine di cellule leucemiche con cellule stromali del midollo osseo per studiare la loro interazione con il microambiente del midollo osseo. Il modello di cocoltura 2D utilizza le cellule di leucemia linfoblastica acuta e gli stromi o gli osteoblasti del midollo osseo che influenzano il fenotipo delle cellule tumorali. Questo studio supporterà l'indagine sui meccanismi che sono alla base della sopravvivenza delle cellule leucemiche supportate dal midollo osseo durante l'esposizione alla chemioterapia.

Protocollo

1. Preparazione avanzata

1. Coltura di cellule stromali del midollo osseo (BMSC) e osteoblasti (OB).
   1. Mantenere sia il BMSC che l'OB a 37 °C in CO₂ al 6% e coltivarli su piastre di coltura tissutale da 10 cm fino a raggiungere la confluenza del 90%.
   2. Tripsinizzare le cellule BMSC o OB e dividere 1:2 su nuove piastre da 10 cm. Le cellule vengono coltivate secondo questi standard fino a quando non sono necessarie per la co-coltura leucemica.

2. Stabilire e Mantenere la Co-Cultura

1. Aggiungere 5-20 x 10⁶ cellule leucemiche in 10 ml di terreno di coltura specifico per il tumore su una piastra BMSC o OB confluente all'80%-90%.
   NOTA: Il nostro laboratorio mantiene le co-colture a 37 °C in 5% O₂ per ricapitolare meglio il microambiente del midollo osseo che ha dimostrato di variare dall'1% al 7%. Tuttavia, il mantenimento di co-colture a questa tensione di ossigeno non è fondamentale per l'insediamento delle tre sottopopolazioni leucemiche ed è a discrezione del laboratorio.
2. Ogni 4^giorni rimuovere tutti i terreni tranne 1 ml (comprese le cellule leucemiche in sospensione) e sostituirli con 9 ml di terreni di coltura leucemici freschi. Quando si rimuovono 9 ml di terreno dalla piastra, fare attenzione a non disturbare le cellule stromali del midollo osseo (BMSC) o lo strato aderente agli osteoblasti (OB).
   1. Rimuovere il fluido inclinando la piastra lateralmente e aspirare il fluido nell'angolo della piastra. Inoltre, quando si aggiungono nuovi supporti, assicurarsi di aggiungere la goccia nell'angolo della piastra contro la parete laterale per garantire un'interruzione minima dello strato aderente al BMSC o all'OB.
3. Dopo il 12° giorno di co-coltura, sciacquare le cellule leucemiche dallo strato BMSC o OB pipettando delicatamente i terreni di coltura dalla piastra su e giù sopra la piastra circa 5-10 volte e quindi raccoglierle in una provetta conica da 15 ml. Riseminare su una nuova piastra BMSC o OB confluente all'80%-90% come descritto al punto 2.1.
   NOTA: Il risciacquo delicato della co-coltura come descritto nella fase 2.3 rimuoverà le cellule leucemiche in sospensione e in fase brillante senza interrompere il monostrato BMSC o OB. Ciò consente di trasferire solo le cellule tumorali alla successiva piastra di co-coltura. Questo ciclo di 12 giorni può essere ripetuto tutte le volte che è necessario in base alle esigenze dell'utente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per colture cellulari da 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Codice 664160
Provette da centrifuga coniche da 15 ml	Prodotti medici in tutto il mondo	41021037	Utilizzato per la raccolta di cellule
Terreni di coltura
Terreni di coltura per osteoblasti	PromoCell	C-27001	Per terreni di osteoblasti umani
Supporti RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Per la prepredazione dei terreni tumorali
Cellule aderenti
Osteoblasti umani	PromoCell	C-12720	Gli osteoblasti umani sono stati coltivati secondo le raccomandazioni del fornitore.
Cellule stromali di Morrow osseo umano	Nucleo di campioni biologici WVU		leucemia umana primaria de-identificata e le cellule stromali del midollo osseo (BMSC) sono state fornite dal Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core e dalla West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank
Cellule leucemiche
Reh	ATCC	Codice ATCC-CRL-8286	Le cellule REH sono state coltivate secondo le raccomandazioni del fornitore e i terreni raccomandati.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Gli SD-1 sono stati coltivati secondo le raccomandazioni del fornitore e i terreni consigliati.

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