Raccolta di sottopopolazioni leucemiche: un metodo per la separazione spaziale di sottopopolazioni di cellule leucemiche dalla co-coltura 2D

Abstract

Fonte: Slone, W. L., et al. Modellazione della leucemia resistente alla chemioterapia in vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video descrive un metodo per la separazione spaziale di tre sottopopolazioni di cellule leucemiche: le cellule leucemiche sospese che fluttuano liberamente nel terreno, le cellule leucemiche luminose di fase che hanno aderito alla superficie del monostrato di cellule stromali mesenchimali e le cellule leucemiche attenuate di fase che sono migrate sotto il monostrato di cellule stromali mesenchimali dalla co-coltura 2D.

Protocol

1. Separare 3 sottopopolazioni all'interno della co-cultura

1. Raccolta della sottopopolazione tumorale in sospensione (S).
   1. Aspirare il terreno dalla piastra di co-coltura con la pipetta e riapplicare delicatamente lo stesso terreno per risciacquare la piastra e raccogliere il terreno contenente cellule leucemiche in una provetta conica da 15 ml. Le cellule leucemiche raccolte sono la sottopopolazione S.
2. Raccolta della sottopopolazione tumorale in fase brillante (PB).
   1. Aggiungere nuovamente 10 ml di terreno fresco sulla piastra di co-coltura. Sciacquare energicamente pipettando il terreno aggiunto su e giù circa 5 volte per rimuovere le cellule leucemiche aderenti, ma non abbastanza forte da rimuovere il componente BMSC/OB aderente.
   2. Aspirare con la pipetta e raccogliere il terreno in una provetta conica da 15 ml. Le cellule raccolte sono la sottopopolazione PB.
3. Raccolta della sottopopolazione tumorale in fase Dim (PD).
   1. Sciacquare la piastra con 1 ml di PBS per rimuovere il terreno rimanente. Tripsinizzare la piastra di co-coltura con 3 ml di tripsina e metterla nell'incubatore a 37 °C per 5 minuti.
   2. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e picchiettare delicatamente i lati della piastra per rimuovere il BMSC/OB aderente.
   3. Aggiungere 1 ml di siero fetale bovino (FBS) e pipettare su e giù 3-5 volte per rompere i grandi aggregati cellulari.
   4. Raccogliere i terreni con le cellule in una provetta conica da 15 ml. Queste cellule sono anche la sottopopolazione PD non purificata con BMSC/OB.
4. Centrifugare 3 sottopopolazioni isolate a 400 x g per 7 minuti. Aspirare e scartare il surnatante, quindi risospendere singolarmente i pellet in un terreno preriscaldato da 1 ml. Le celle sono pronte per essere caricate su una colonna G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da centrifuga coniche da 50 ml	Prodotti medici in tutto il mondo	41021039	Soluzione conservante per Campioni citologici
Provette da centrifuga coniche da 15 ml	Novacyt	Na	Utilizzato per la raccolta di cellule
Siero fetale bovino	sigma	F6178
0,05% Tripsina	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
Piastre per colture cellulari da 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Codice 664160
Cultura media
Terreni di coltura per osteoblasti	PromoCell	C-27001	Per terreni di osteoblasti umani
Supporti RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Per la prepredazione dei terreni tumorali
Linee cellulari
Osteoblasti umani	PromoCell	C-12720	Gli osteoblasti umani sono stati coltivati secondo le raccomandazioni del fornitore.
Cellule stromali di Morrow osseo umano	Nucleo di campioni biologici WVU		leucemia umana primaria de-identificata e le cellule stromali del midollo osseo (BMSC) sono state fornite dal Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core e dalla West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. Le colture BMSC sono state stabilite come descritto in precedenza (*)
Cellule leucemiche
Reh	ATCC	Codice ATCC-CRL-8286	Le cellule REH sono state coltivate secondo le raccomandazioni del fornitore e i terreni raccomandati.
SD-1	DSMZ	ACC 366	Gli SD-1 sono stati coltivati secondo le raccomandazioni del fornitore e i terreni consigliati.