1. Caricamento delle cellule di co-coltura sulla colonna G10
NOTA: Assicurati che il rubinetto sia completamente chiuso prima di aggiungere supporti contenenti celle alla colonna G10. Inoltre, ogni sottopopolazione deve essere analizzata su una colonna G10 separata in modo da non introdurre distorsioni tra le popolazioni nell'analisi a valle.
- Utilizzando una pipetta da 1.000 μl, aggiungere 1 ml di ciascuna sottopopolazione cellulare in terreno preriscaldato a una colonna G10 separata a goccia. Assicurarsi che il supporto contenente le celle rimanga sopra o all'interno del pellet G10. Lasciare incubare le cellule su pellet G10 per 20 minuti a RT.
nota: Il rubinetto rimane chiuso per tutta la durata dell'incubazione.
2. Raccolta di cellule leucemiche dalla colonna G10
- Aggiungere 1-3 ml di terreno preriscaldato a ciascuna colonna G10. Aprire la valvola del rubinetto e consentire al fluido di uscire lentamente dalla colonna in senso di caduta.
nota: È fondamentale mantenere una bassa portata dalla colonna, altrimenti il pellet G10 contenente BMSC/OB può essere lavato via dalla colonna e contaminare le cellule leucemiche isolate.
- Continuare ad aggiungere il terreno preriscaldato con piccoli incrementi (1-2 ml) alla colonna G10 fino a quando un totale di 15-20 ml non è passato attraverso la colonna ed è stato raccolto. Chiudere la valvola del rubinetto e il tubo di raccolta del tappo.
nota: Se si nota un pellet di particelle G10 sul fondo della provetta di raccolta, rimuovere delicatamente il materiale dalla provetta lasciando indisturbato il pellet di particelle G10 e trasferirlo in una nuova provetta.
- Centrifugare il terreno raccolto a 400 x g per 7 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cella in un tampone appropriato per l'applicazione a valle.
- Le cellule sono ora una popolazione pura di cellule leucemiche prive di contaminazione BMSC o OB e sono pronte per essere applicate alle applicazioni a valle a discrezione dell'utente.
NOTA: La vitalità delle cellule leucemiche deve rimanere invariata quando si passano le cellule attraverso le colonne G10.
